1. 서 론

급격한 산업화 및 도시화, 국민의 생활수준 향상 등으로 1980년대 이후 우리나라의 주유소, 유류저장 탱크 등의 유류저장 시설 수 및 유류 사용량이 급격히 증가하였다. 주유소의 수가 1990년 대비 400% 이상 증가 되는 등(Shin et al., 2014), 전국에 유류활용 시설이 널리 퍼져 있으며, 이에 따라 누출 등의 원인으로 인한 유류오염이 도로 및 도시 지역 토양의 대표적인 비점오염으로 인식되었다. 토양의 유류오염은 지하수 오염으로 확산될 수 있고, 매체의 특성상 대기 및 수질오염에 비해 정화하는데 많은 시간 및 막대한 비용이 소요된다(Yun et al., 2003). 이에 따라 미국 등 선진국들은 마이크로코즘 실험을 통해 토양의 유류오염 분해능을 평가하는 위해성평가기법을 사용, 유류 오염된 토양의 위해성 및 토양의 정화능력을 평가하여 유류오염 정화의 기술을 선정하는 등, 효율적인 유류오염처리를 위하여 노력하고 있다(Yun et al., 2003). 또한 토양의 오염정화능력 평가를 통해, 토양의 정화능력을 고려한 절/성토 설계 등 새로운 친환경 건설기술 창출에 기여할 것이므로, 토양의 유류오염분해 능력 평가는 미래 건설 분야에서 필수적이다. 그러나 광범위한 지역에 오염되는 유류오염의 특성 상, 마이크로코즘을 이용해 유류오염토양의 분해능 및 분해속도를 추정하여 토양의 정화능력을 평가하는 방법은 시간적, 경제적 제약이 많다. 이를 해결하기 위해 미생물 다양성을 이용하여 토양의 정화능력을 추정하는 방법이 제시된 바 있다. Kim et al. (2014)는 불투수면 감소와 저류를 통해 토양, 지하수 환경을 개선하는 저영향개발기법(Low Impact Development)이 적용된 토양을 분석하여, 오염정화능력이 좋은 저영향개발기법 토양의 미생물 다양성이 높으며, 이를 토대로 미생물 다양성을 오염정화능력의 지표로 제시한 바 있고, Johnson et al. (2015)은 하수처리장의 활성슬러지 시료를 분석한 결과, 미생물 다양성과 오염물질 제거를 포함한 미생물의 기능간에 상관성이 있음을 밝힌 바 있다. 그러나 토양에서의 미생물 다양성과 오염 정화능력간의 상관성 및 정화능력 추정기법에 대한 연구는 부족하다. 미생물 다양성을 측정하기 위해 다양한 배양 비의존적인 DNA fingerprinting 기술이 개발되었고, 그 중 T-RFLP (Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) 방법은 다른 기술들에 비해 장점이 많아 널리 사용된다. T-RFLP은 형광색소로 라벨링을 한 primer을 이용하여 PCR을 한 후 시료를 제한 효소로 절단하고 DNA 단편들을 분리하여 미생물 군집 및 다양성 분석을 하는 방법으로, 레이저 검출기술의 개발로 다른 fingerprinting 기술에 비해 해상도와 감도가 좋으며 재현성의 측면 및 시료의 처리속도가 빠르다는 장점이 있다(Ranjard et al., 2000; Shim and Lee, 2008). 이와 같이 시간적, 경제효율적인 T-RFLP을 통해 미생물 다양성을 분석하고 이를 통해 토양의 유류오염정화능력을 평가할 수 있다면 기존의 마이크로코즘 방법을 대체하여 현장에서도 효율적으로 사용할 수 있다. 이에 따라 본 연구에서는 미생물 다양성 지표를 이용하여 유류오염물질 분해속도 등과 같은 유류오염 정화능력을 추정하는 기법을 개발하는 것을 목적으로 한다. 연구 대상 유류오염물질로는 가솔린의 주 오염원이자 화학적 특성으로 넓은 지역에 오염되기 쉬운 BTEX 중, 국내 유류오염 부지의 대표적인 오염물질인 톨루엔을 대상으로 하며(Chung, 2002), 토양의 호기성 분해속도와 미생물 다양성관의 상관관계를 실험실 규모의 마이크로코즘 실험 및 T-RFLP을 통해 분석하였다.

2. 연구방법

2.1 톨루엔 분해 마이크로코즘 실험

마이크로코즘 실험은 미생물 다양성이 다양한 토양 10가지의 톨루엔 분해 속도를 측정하는 것을 목표로 진행하였다. 실험에 사용된 토양은 충청남도 천안시 신도시개발지역 인근에 pilot 규모로 설치한 저영향개발기법 실험 토양 3종(시료 1~3번), 인근 나대지 토양 2종(시료 4, 5번), 인천시 강화도 길상면 갯벌 토양 2종(시료 6, 7번), 서울시 서대문구 신촌로 공사현장 토양(시료 8번), 서울시 연세대학교의 잔디밭(시료 9번), 서울시 서대문구에 위치한 안산 토양(시료 10번)이다. 각 토양을 이용한 마이크로코즘 실험은 160 ml 세럼 바틀에 토양 16 g (10 ml bulk)과 미디아 50 ml를 넣고 공기 100 ml의 headspace로 구성하였다. 톨루엔의 완전 호기성 분해에 필요한 산소의 양은 1 mol 톨루엔(C₇H₈) 당 9 mol 산소로(C₇H₈+9O₂ → 7CO₂+4H₂O (Yu et al., 2001)) headspace의 공기로 필요 산소를 충당할 수 있음을 알 수 있다. 미디아에는 대책기준 농도(60 mg/L,)보다 높은 톨루엔 110±14.1 mg/L를 주입하였으며 trace element solution으로(mg/L) NH₄Cl (100), KH₂PO₄ (700), K₂HPO₄ (1,000), NaCl (10), CaCl₂ (5), MgCl₂ (10), CuCl₂·2H₂O (0.0392), ZnCl₂ (0.1363), NiCl₂ (0.013), FeCl₂·4H₂O (0.7016), AICi₃ (0.1106), MnCl₂·4H₂O (0.2807), CoCi₂·6H₂O (0.0382), Na₂MoO₄·2H₂O (0.0254), H₃BO₃ (0.0382), Na₂SO₄ (0.1420), biotin (0.02), folic acid (0.02), pyridoxine HCl (0.1), riboflavin (0.05), thiamine (0.05), nicotinic acid (0.05), pantothenic acid (0.05), vitamin B12 (0.001), p-aminobenzoic acid (0.05를 첨가하였다(Alvarez and Vogel, 1991). 배양 조건은 25°C의 온도에서 150 rpm으로 교반하였으며 각 실험은 모두 duplicate로 진행하였다. 토양의 정화능력으로 인한 톨루엔 농도 변화는 실험 구성 후 12시간의 교반을 통해 headspace 내 톨루엔의 농도를 평형 상태에 도달하게 한 후 headspace의 기체를 gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID)로 주기적으로 분석하여 측정하였다. GC의 Detector 온도는 200°C이며 column은 19091P-QO4 (30 m × 0.320 mm × 20.0 um)을 사용하였고 carrier gas는 질소 가스를 1.7 ml/min의 flow rate로 사용하였다. Inject의 온도는 200°C로, oven의 온도는 100°C에서 2분 고정 후 10°C/min의 속도로 225°C까지 올린 후 1분 고정 후 측정하였다.

2.2 미생물 다양성 분석

각 토양 시료는 FastDNA Spin Kit for Soil (MP Bio 101, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 미생물의 정량적 분석을 위한 quantitative-polymerase chain reation (qPCR)과 미생물 다양성 분석을 위한 T-RFLP을 진행하였다. qPCR은 SYBR Green 방법을 사용하였으며 primer은 전체 박테리아를 대상으로 한 Bac 1055YF (ATGGYTGTCGTCAGCT), Bac 1392R (ACGGGC-GGTGTGTAC) (Park et al., 2009)을 첨가하였다. T-RFLP은 16S rRNA 유전자와 다양한 가솔린 분해에 사용되는 aromatic ring hydroxylating dioxygenase (ARHD) 유전자들을 대상으로 PCR을 수행한 후 진행하였다. 16S rRNA 유전자 분석에 사용된 primer은 형광물질이 부착된 27F-FAM (AGAGTTTGATCC-TGGCTCAG), 1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT) (Hayashi et al., 2003)를 사용하였으며, ARHD 유전자 분석에 사용한 primer은 forward 5’-TGCASSTWTCACGGSTGG-3’, reverse 5’- CTCGACTCCGAGCTTCCAGTT-3’이다(Kim et al., 2004). 증폭된 PCR산물에 HhaI 제한효소를 반응시킨 제한 효소 반응 실험을 진행하였으며, 이후 군집구조 분석은 Microbial Community Analysis (http://mica.ibest.uidaho.edu)의 database를 통해 분석하였다.

2.3 상관성 분석

분해 특성과 미생물 다양성간의 상관관계를 알아보기 위해 분해 특성으로는 톨루엔 분해속도(DR, mg-toluene/g-soil/hr), 1 mg cell 당 톨루엔 분해속도를 나타내는 specific degradation rate (V_max, mg-toluene/mg-cell/hr)를 분석하였으며 미생물 다양성 인자로는 1 g 토양 당 세균세포 무게(mg cell, mg-cell/g-soil), 16S rRNA 유전자(16S)의 Shannon index, Richness, Evenness, ARHD 유전자(ARHD)의 Shannon index, Richness, Evenness를 분석하였다. 이 후 분해 특성 인자들의 역수 및 로그 값을 포함한 각 인자들 간의 상관성을 SPSS 통계분석 프로그램으로 Pearson 상관계수 및 유의확률(p-value)을 도출하여 분석하였다. 상관성 분석으로 얻은 상관식을 통한 오염정화모듈을 제작하기 앞서, 톨루엔 분해속도 중 lag time을 추론하기 위한 추가 실험을 진행하였다. 앞서 실험한 토양들에 유류오염분해 미생물제재를 다양하게 추가하여 얻은 샘플 총 23가지의 lag time을 분석하여 미생물 다양성 인자들과의 상관관계를 이전과 동일하게 SPSS로 추론하고 상관식을 도출하였다. 이렇게 얻은 인자들을 대표적인 반응속도 모델로 알려진 Michaelis-Menten kinetics에 대입해 미생물 다양성으로 토양의 유류오염 정화능을 평가하는 모듈을 제작하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1 상관식 도출

총 10가지의 다양한 토양들의 톨루엔 분해는 모두 약 48시간 정도의 lag time을 가진 후 96시간 이후에는 모두 95%이상 제거율을 보였다. 톨루엔의 분해속도를 나타내는 DR (mg/L/hr)은 토양의 종류에 상관없이 다양한 결과를 보였으나, DR을 세균세포 무게로 나눈 specific degradation rate (V_max, mg-toluene/mg cell/hr)은 저영향개발기법을 적용한 토양(시료 1~3번)이 일반 나대지 토양(시료 4~10번)보다 높은 결과를 보였다(Fig. 1). 각 토양 시료의 미생물 다양성들을 분석한 결과는 Table 1과 같다. V_max가 높은 시료 1~3번의 경우, 16S rRNA 유전자 Shannon index를 비롯한 모든 미생물 다양성 값들이 시료 4~10번 보다 높은 경향을 보인다. 이는 저영향개발기법 토양이 토양, 지하수 환경의 조성이 잘되어 있고 오염저감 및 생태기능에 좋다는 결과를 뒷받침 한다(Ahiablame et al., 2012).

분해특성 인자인 V_max가 높은 샘플에서 미생물 다양성 값들이 높아짐에 따라 분해 특성과 미생물 다양성 인자간의 상관성이 있다는 가능성이 제시되며, 이에 따라 Pearson 상관계수와 유의확률(p-value)을 사용한 상관성 분석을 Table 2와 같이 분석하였다. 먼저 p-value를 통해 유의성이 있는(p-value<0.05) 인자들은 16S rRNA 유전자의 Shannon index와 V_max의 역수, 그리고 16S rRNA 유전자의 evenness와 V_max의 역수이다. ARHD 유전자의 다양성과는 상관성이 적은 것으로 나타났는데 이는 ARHD가 톨루엔만을 분해하는 유전자가 아닌 벤젠, 나프탈렌 등의 가솔린 성분 및 poly aromatic hydrocarbon (PAH)과 같은 다양한 유류오염물질의 분해에도 영향을 미치는 유전자이기 때문인 것으로 보인다. 특히 본 연구에 사용한 primer은 toluene dioxygenase 유전자의 검측이 가능하나 특정적으로 검측할 순 없고, 톨루엔 분해에 기여하는 toluene monooxygenase 유전자의 검측이 불가능한 점도 상관성이 낮게 나온 이유가 된다. 톨루엔 정화능력이 특정 분해 유전자의 다양성과 높은 상관성이 나올 수 있으나, 톨루엔 분해에는 굉장히 다양한 유전자들이 상호작용을 하며(Wackett, 1990; Furkawa et al., 1993; Kukor and Olsen, 1996), 여러 유류오염물질들이 복합적으로 오염되어 있는 실제 현장에 적용하기에는 무리가 있다. 이와 같은 이유로 특정 톨루엔 분해 유전자의 다양성보다는 전체 유전자의 다양성을 대변하는 16S rRNA 유전자 Shannon index나 evenness가 분해 특성을 대변하기 좋을 것으로 보이며, 두 다양성 인자 중 미생물 다양성 대표성이 높고 Pearson 상관계수 및 p-value에서도 상관관계가 더 높은 것으로 나타난 16S rRNA 유전자 Shannon index를 미생물 다양성인자로 선정하여 V_max와 회귀분석을 진행하였으며 그 결과는 Fig. 2와 같다.

16S rRNA 유전자 Shannon index가 클수록 토양의 정화능력을 나타내는 V_max는 커지며, 특히 Shannon index의 값이 3.5 이상인 경우에는 V_max의 값이 급격히 증가하는 양상을 나타낸다. 일반적인 자연 토양의 16S rRNA 유전자 Shannon index는 보통 4를 넘지 않는 것으로 알려져 있어(Ki, 2008), 본 상관식을 사용하여 V_max를 추론할 경우, Shannon index가 4가 넘는 토양에 대해서는 어느 정도 보정이 필요하다. 톨루엔 분해 미생물 순수 균주 및 consortium의 V_max는 2.11~2.44/hr로 알려져 있으며, 일반 자연 조건에서는 0.41~1.45/hr로 알려져 있어(Table 3), 본 상관식의 타당성을 알 수 있다. 본 상관식은 일정 16S rRNA 유전자 Shannon index까지는 기울기가 미미하다 일정 값 이상이 되면 급격히 증가하여, 일반 자연 토양 Shannon index 최대값인 4까지 기울기가 커진 선형 관계를 보이는 양상이다. 이는 Johnson et al. (2015)이 밝힌 하수처리장의 다양성과 기능간 상관관계가 선형이라는 결과와 유사하다. 즉, 토양과 하수처리장에서의 다양성과 분해 특성과 같은 기능간 상관성은, 일정 다양성 값 이상에서는 기능이 일정한 decelerating shape가 아닌 선형에 가까운 Non-decelerating shape이다. 그러나 본 연구 결과 특정 다양성 값을 기준으로 이전과 이후의 Non- decelerating shape의 기울기가 달라지며 저영향평가기법 토양과 같이 의도적으로 다양성을 자연토양보다 높인 환경에서는 그 기울기가 급격히 커짐을 알 수 있다. 이는 미생물 제재 등을 추가한 토양에서의 분해 특성을 미생물 다양성 값으로 추론할 때 오차가 큼을 나타내며 이를 보정하는 추가 연구가 필요함을 시사한다.

3.2 토양의 유류오염정화능력 평가 수치 모형 개발

토양의 유류오염정화능력은 미생물 다양성 지수인 Shannon index를 Fig. 2의 상관식에 대입하고, 도출한 V_max를 대표적인 반응속도 모델인 Michaelis-Menten kinetics에 대입함으로써 평가할 수 있다. Michaelis-Menten kinetics로 특정 톨루엔 농도를 목표 시간까지 분해하는데 필요한 미생물 양을 구할 수 있으며, 이를 실제 토양의 미생물양과 비교하여 토양의 자연정화 가능 여부를 평가한다. Michaelis-Menten kinetics는 Eq. (1)과 같다.

 (1)

여기서, 는 토양의 오염물질(톨루엔) 분해속도(DR, mg/L/hr)

이며, V_max는 specific degradation rate (hr^-1), S는 톨루엔의 농도이고, X₀는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil), Ks는 토양의 half saturation coefficient (mg/L)이다. 이 식을 적분하여 토양의 미생물 농도 X₀에 대한 식으로 바꾸면 Eq. (2)와 같다.

 (2)

여기서, S₀는 토양의 초기 톨루엔 농도(mg/L)이고 S는 t시간 후 톨루엔 농도(mg/L)이며 t는 분해시간(hr)이다. 다만 본 실험결과 토양의 톨루엔 분해에는 lag time이 있어 이를 고려할 필요가 있다. 위에서 실험한 10가지 자연 토양 외 미생물 제재를 추가로 투여한 실험 총 23종의 톨루엔 분해 lag time과 미생물 생태학적 특성 간 상관관계를 분석한 결과 lag time과 x()의 역수간에 상관성이 있어 회귀분석을 한 결과 Fig. 3과 같은 상관식이 나온다. 이를 보정한 lag time과 x간의 상관식은 Eq. (3)과 같다.

 (3)

여기서, L은 lag time(hr), α는 상관계수이고 그 값은 0.0631 hr이며 x는 이다. Lag time을 고려한 최종 식은 Eq. (4)와 같다.

 (4)

위 식에서 K_s는 토양의 aging effect나 풍화 작용 및 미생물 제재 등에 의해 바뀔 수 있으며 현장토양에 맞는 특정 값을 사용한다. 본 연구에서는 Table 3의 문헌조사로 나온 일반적인 자연토양의 값 17.4 mg/L를 예시로 사용한다. Eq. (4)는 특정 토양의 톨루엔 자연저감능을 평가하는데 사용할 수 있다. 먼저 토양의 16S rRNA 유전자 Shannon index를 T-RFLP을 통해 분석한 후 Fig. 2의 상관식을 통해 V_max를 구한다. 이후 qPCR을 통해 토양의 ARHD 유전자 수 및 16S rRNA 유전자 수를 구해 x를 산출하고 Eq. (3)를 통해 lag time (L)을 분석한다. 이렇게 구한 L과 V_max 및 토양의 특성에 맞는 K_s를 Eq. (4)에 대입하고, 목표 처리 시간(t)과 초기 톨루엔 농도(S₀), 목표 정화 농도(S)를 대입하면, 목표 처리시간 내 목표 정화 농도 만족을 위한 토착 미생물 농도 X₀를 추정할 수 있다. 이렇게 구한 X₀를 현장 토양 미생물 농도 X와 비교하여 X가 X₀보다 높다면 자연정화가 가능한 토양으로 추정할 수 있다. 다른 활용방안으로는 X₀에 현장 토양 미생물 농도를 대입하고 초기 톨루엔 농도 및 목표 정화 농도를 대입하여, 목표 농도까지 토양이 톨루엔을 정화하는데 소요되는 시간을 산정할 수 있다. Table 4는 활용방안 예시이다. x값이 일반적인 자연 토양의 값인 0.001이고(L=63.1 hr), 목표 처리 시간(t)이 240 hours이며, 목표정화 농도(S)가 20 mg/L일 때 토양의 16S rRNA 유전자 Shannon index와 초기 톨루엔 농도(S₀)별로 정화에 필요한 토착 미생물 농도 X를 나타내었다. 그 값들을 그래프화 시키면 Fig. 4와 같으며, 목표 정화 시간이 짧을수록, 초기 톨루엔 농도가 높을수록, 그리고 토양의 16S rRNA 유전자 Shannon index 값이 낮을수록 정화에 필요한 토착 미생물 농도 X가 커짐을 알 수 있다. 이렇게 구한 X의 값을 평균 산정하는 등 보정하여 실제 토양의 토착 미생물 농도와 비교하여 자연저감 가능 여부를 판단할 수 있다.

4. 결 론

본 연구를 통해 얻은 결론은 다음과 같다. 먼저 토양의 미생물 다양성 인자와 톨루엔 분해 특성 인자간의 상관관계가 있음을 규명하였으며, 16S rRNA 유전자 Shannon index와 토양의 specific degradation rate간의 상관식을 도출하였다. 두 번째로 위 상관식 및 Michaelis-Menten kinetics를 이용하여 16S rRNA 유전자 Shannon index 값 및 x()와 같은 분자 생태학적 인자들 만으로 토양의 오염정화능력을 평가할 수 있는 모듈을 획득하였다. 이를 통해 기존의 오염정화능력 평가 기법보다 시간적, 경제적으로 효율적인 토양의 톨루엔 오염정화능력 평가 기법을 제시하였다. 또한 본 연구진에서 제안한 광범위한 지역의 T-RFLP 다양성 지표 지도화 기법(Kim et al., 2011)을 적용한다면 미생물 다양성 분석을 통해 넓은 지역 토양의 유류오염정화능력을 지도화 할 수 있어, 절/성토 설계와 같이 건설 분야에 활용할 수 있는 등, 공학적으로 큰 의의가 있다. 특히, 유류오염 토양의 정화기법 선정 및 오염정화능력을 이용한 건설 산업의 친환경적 설계 등에 활용 되는 등 공학적으로 광범위한 분야에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.