1. Introduction

축산업의 발달에 따라 동물 치료와 감염 예방, 생산성의 향상을 목적으로 다양한 종류의 동물용 항생제가 사용되고 있다. 식품의약품안전처와 농림축산식품부의 보고에 따르면 2014년 기준 식용 동물(소, 돼지, 닭, 수산용)에 사용을 목 적으로 판매된 항생제는 635톤으로 나타났고(^{Lim et al., 2015}) 미국과 EU 국가들의 연간 항생제 판매량과 비교하 여도 높은 순위를 차지하고 있다(Fig. 1). 우리나라와 유럽 은 가축 사료에 항생제를 첨가하는 것을 금지하고 있으며 항생제 사용을 위해서는 처방전이 필수적으로 필요하지만 여전히 많은 양이 사용 중이며(EU, 2003; ^{USDA, 2011}) 이 렇게 소비된 항생제는 다양한 경로를 통해 환경으로 유입 되어 잠재적인 위해를 야기할 수 있으리라 예측되고 있다.

Fig. 1. Annual sales of veterinary antimicrobials for foodproducing animals in 2013 (European medicines agency, 2015) a: sales in 2014 (U. S. FDA, 2015); b: sales in 2014 (Lim et al., 2015).

가축용 항생제의 상당부분은 모화합물 그대로 또는 활성 상태의 대사물질 형태로 대변·소변을 통해 배출되기 때문에 (^{Sarmah et al., 2006}) 돼지(^{Jacobsen and Halling-Sorensen, 2006}; ^{Martinez-Carballo et al., 2007}; ^{Zhao et al., 2010}), 소 (^{Zhao et al., 2010}), 가금류(^{Martinez-Carballo et al., 2007}; ^{Zhao et al., 2010}) 등의 분뇨에서 수백 mg/kg 수준의 농도 로 여러 종류의 항생제가 빈번하게 검출되어 왔다. 또한 축산업의 특성상 축산폐수 처리시설이 갖추어지지 않은 중 소규모의 농가가 다수 분포되어 있고, 퇴비화 및 유통, 살 포과정에서 알려지지 않은 경로로 오염물질이 유출될 가능 성이 매우 크다. 실제로 하수처리장의 슬러지뿐 아니라 가 축 농장 주변의 토지나 퇴비를 뿌린 경작지에서 다양한 종 류의 항생제가 검출되는 것으로 조사되었다(Table 1).

환경 중 잔류 항생제의 검출뿐 아니라 잔류 항생제가 생 태계 및 인체에 미치는 영향에 대한 연구도 다양하게 진행 되어 왔는데 수 ng/L~μg/L 농도로 검출되는 수준에서도 수 생생물의 세포성장이나 생식기능을 저하시키는 등 생태계 에 악영향을 주는 것으로 보고되고 있다(^{Liu and Wong, 2013}; ^{Rahman et al., 2009}). ^{Migliore et al. (1998)}와 ^{Migliore et al. (2003)}은 술파디메톡신(sulfadimethoxine)과 엔로플록 사신(enrofloxacin)이 식물의 성장을 저하하는 독성을 나타 내는 것을 보고하기도 하였다.

^{Malch et al. (2014)}은 잔류 의약물질이 존재하는 하수처 리장 처리수를 이용해 당근, 고구마 등을 재배하여 검출되 는 의약물질을 조사하고 재배된 뿌리식물의 섭취가 인간의 건강에 미치는 영향을 평가하였다. 카바마제핀(carbamazepine), 카페인(caffeine), 라모트리진(lamotrigine) 등이 뿌리 와 잎에서 검출되었고, 매일 당근을 섭취할 경우 아이들에 게 독성을 나타낼 수 있다고 보고하였다. 또한 ^{Pomati et al. (2008)}은 인체 세포로 의약물질의 독성을 평가하여 ng/L 수준으로 존재하는 베자피브레이트(bezafibrate), 아테놀롤 (atenolol), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 린코마이신(lincomycin) 이 세포증식을 억제하여 임산부와 신생아에게 위험 성을 나타내는 것을 보고하기도 하였다.

특히 잔류항생제로 인해 발생하는 항생제 내성 박테리아 의 위험성에 대한 연구와 새로운 항생제의 개발은 오랜 기간 지속되어 왔다(^{Bonnet, 2004}; ^{Chander et al., 2011}; ^{Fischbach and Walsh, 2009}; ^{Hasman et al., 2005}; ^{Hur et al., 2012}; ^{Kim et al., 2012}; ^{Neu, 1992}; ^{Persoons et al., 2011}; ^{Pfeifer et al., 2010}; ^{Straus and Hancock, 2006}). 그럼에도 불구하고 하수 및 하수슬러지(^{Biswal et al., 2014}; ^{Chen and Zhang, 2013}), 물놀이 공간(^{Santiago-Rodriguez et al., 2013}), 육·어류 가공식품(^{Carretero et al., 2008}; ^{Chafer-Pericas et al., 2010}; ^{Wan et al., 2006}; ^{Xu et al., 2012}) 등 다양한 시 료에서 항생제 내성 미생물의 검출이 보고되고 있고, 인간 은 여러 경로를 통해 항생제 내성균에 노출된다. 미국 보 건사회복지부에서 발표한 자료에 따르면 미국에서만 항생 제 내성균에 의해 연간 2백만 명 이상의 환자와 2만 3천명 의 사망자가 발생하였다(^{CDC, 2013}).

이러한 다양한 환경적, 보건적 문제가 보고되고 있음에도 불구하고 우리나라를 포함한 많은 나라들은 하수처리 비용 의 절감, 분뇨 중의 인, 질소 회수 및 자원화를 목적으로 가축분뇨를 퇴비화하여 농업 비료로 사용하고 있다. 퇴비의 양이 이미 경작지에서 필요로 하는 수준을 넘고 있으며 (^{Kim et al., 2015}; ^{Kim et al., 2005}; ^{OECD, 2001}) 퇴비의 반출입량과 시비량 등에 대한 파악이 부정확하여 이로 인 한 환경오염의 가능성은 높을 것으로 예상되나 과학적인 실태파악이 어려운 상황이다. 뿐만 아니라 응집-침전-모래 여과를 통한 입자물질 제거를 주요 메커니즘으로 설계된 기존의 정수처리기술(^{Adams et al,. 2002}; ^{Kim et al,. 2007}; ^{Stackelberg et al., 2004})과 하수처리기술의 활성슬러지법 (^{Clara et al., 2005}; ^{Radjenovic et al., 2009})은 지하수나 지 표수로 유입되는 대부분의 의약물질을 제거하기 어려운 것 으로 알려져 있어 축산업에서 항생제의 사용 특성과 환경 중 영향을 평가할 수 있는 방안 마련에 대한 요구가 지속 되어 왔다.

이에 따라 2015년 환경부는 비료의 공급량, 가축분뇨 등 으로 인한 환경오염 실태를 조사하고 축산업에 의해 발생 하는 잔류 항생물질의 거동 조사 등을 포함한 ｢가축분뇨의 관리 및 이용에 관한 법률｣과 ｢가축분뇨실태조사의 세부 절차 및 방법 등에 관한 고시｣를 제정·발표하였다(^{Korea Ministry of Government Legislation, 2015}). 고시에 따르면 실태 조사를 위해 가축분뇨, 하천 및 호소, 지하수 등의 시 료를 채취하고, 기본적인 수질측정 항목을 비롯해 중금속, 악취 및 잔류항생물질의 농도를 측정하게 된다. 조사방법으 로 ｢비료의 품질검사방법 및 시료채취기준｣, ｢수질오염공 정시험기준｣, ｢토양오염공정시험기준｣, ｢악취공정시험법｣ 등 을 따르도록 명시하고 있으나 잔류항생물질을 분석하기 위 한 표준시험방법을 언급하지 않고 있다. 미국 EPA method 1694에서 고체, 액체 시료에 대해 액체크로마토그래피(HPLC) 와 질량분석기(MS)를 사용하는 잔류의약물질의 분석방법을 제안하고 있으나 가축분뇨에 대한 전처리방법을 설명하지 는 않았다(^{U. S. EPA, 2007}). 액체크로마토그래피와 질량분 석기를 이용하여 하천 및 호소수 등 액체 시료의 잔류 항 생제를 분석하는 방법은 총설 II에서 고찰한 바와 같이 다 양한 계열의 항생제를 대상으로 연구가 진행되어 왔으나, 고체 시료를 대상으로 한 연구는 상대적으로 부족한 상태 이다. 인간의 공공보건과 직접적인 연관성으로 인해 식재료 인 생선(^{Evaggelopoulou and Samanidou, 2013}; ^{Kaufmann et al., 2012}; ^{Lopes et al., 2012}; ^{Xu et al., 2012}), 육류 (^{Berendsen et al., 2013}; ^{Bousova et al., 2013}; ^{Carretero et al., 2008}; ^{Tao et al., 2012}; ^{Zhu et al., 2008}) 등의 고형 시료를 대상으로 전처리방법을 개발하고 실제 제품을 대상 으로 잔류항생제 농도를 측정하여 보고한 사례가 있으나 가축분뇨, 퇴비중의 항생제 분석방법을 제시한 연구는 상대 적으로 미미한 것으로 나타났다(^{Gorissen et al., 2015}; ^{Zhao et al., 2010}; ^{Zhou et al., 2012}).

더욱이 진행된 연구에서 제안된 잔류 항생제 분석방법은 그 대상물질의 범위가 제한적이고, 다종의 항생제 계열에 적용 가능하도록 정립된 분석 방법이 없어 대부분의 연구 는 테트라사이클린계(tetracyclines), 설폰아마이드계(sulfonamides), 플로로퀴놀롤계(fluoroquinolones) 항생제를 주로 분석하고 있고 린코마이신(lincomyvin), 플로르페니콜(florfenicol), 콜리스틴(colistin), 클로피돌(clopidol) 등의 동물용 의약품에 대한 연구는 극히 드물게 나타나고 있다(^{Ben et al., 2008}; ^{Chen et al., 2012}; ^{Jacobsen and Halling-Sorensen, 2006}; ^{Karci and Balcioglu, 2009}; ^{Watanabe et al., 2010}; ^{Zhao et al., 2010}). 따라서 축산농가와 농가 주변의 토양, 하천 등 환경에 대한 실태 조사와 동물용 잔류 항생제의 영향에 대한 심도 있는 평가를 위해서는 다양한 계열의 항생제를 측정할 수 있는 방법에 대한 조사와 이해가 필요하다.

본 연구에서는 1) 동물용 항생제의 국내 판매량 순위를 검토하여 대상 물질을 선정하고, 2) LC-MS를 이용해 선정 된 물질을 분석하기 위한 고체 시료의 전처리 과정을 조사 하여 향후 가축분뇨 중 잔류항생물질의 분석 방법에 대한 기초 자료를 마련하고자 하였다.

2. Selection of Veterinary Antibiotics

대상물질을 선정하기 위하여 국내 가축용 항생제 판매순 위를 조사하였다. 판매량은 『2014년도 국가항생제 사용 및 내성 모니터링』 (^{Lim et al., 2015})자료를 인용하였다. Fig. 2 는 연간 판매량이 5톤을 넘는 항생제에 대해 축종별 판매 량을 보여준다. 22종의 항생제가 연 5톤 이상 판매되고 이 중 15종의 항생제는 돼지용으로 가장 많이 판매되었다. 소 와 돼지용으로는 아목시실린(amoxycillin)이, 가금류용으로 는 살리노마이신(salinomycin)이 가장 많이 판매되는 것으 로 조사되었다. Fig. 3은 판매량 상위 10~50종을 선정 기준 으로 하였을 때 선정된 항생제의 연간 판매량이 전체 판매 량에서 차지하는 비율을 보여주고 있다. 상위 10종과 20종 의 항생제만을 선정할 경우, 판매량이 차지하는 비율은 각 각 73%와 87%이고, 상위 40종과 50종의 항생제를 선정할 경우 선정된 판매량은 98%와 99%를 차지하는 것으로 나 타났다. 선정된 항생제가 판매된 전체 항생제를 대변하기에 충분하도록 판매량이 차지하는 비율을 90% 이상으로 하여 적정 수의 대상물질을 선정코자하였고 상위 30종을 선정하 여 축종에 따라 중복되는 물질과 염(salt)의 형태로 판매되 는 물질들을 고려하였을 때, 약 95%의 판매비율을 갖는 37종의 대상물질이 선정되었다(Table 2). 선정된 37종의 항 생제는 최소 12개 이상의 계열로 분류되며 다음과 같이 계 열별로 상이한 화학적 특성을 갖는다.

Fig. 2. Annual sales of major antibiotics with livestock species in South Korea, 2014 (Lim et al., 2015).

Fig. 3. Comparison of proportions of selected antibiotics sales according to the number of the antibiotics.

테트라사이클린계는 나프타센(naphthacene)구조를 골격으 로 하고 산에서 비교적 안정적이나 염기에서 불안정하며 빛 에 의해 쉽게 분해되는 특성을 갖는다(^{Halling-Sorensen et al., 2002}). 또한, 2가, 3가의 금속이온과 킬레이트 화합물을 형성하고 실리카의 실라놀 작용기(silanol groups)와 강하게 결합한다(^{Halling-Sorensen et al., 2002}; ^{Oka et al., 2000}; ^{Petrovic et al., 2005}). 플로로퀴놀론계는 가수분해와 온도의 증가에 안정적이지만 광분해 되기 쉽다(^{Pico and Andreu, 2007}). 테트라사이클린계, 플로로퀴놀론계와 비교하여 설폰 아마이드계 항생제는 토양 중에서 흡수나 흡착하는 성질이 약하기 때문에 매우 이동이 자유로운 특징이 있고(^{Tolls, 2001}), 이러한 이유로 자연수 중에서 매우 빈번하게 검출되 는 계열 중 하나이다. 매크로라이드계 항생제는 10개 이상 의 탄소를 포함하는 락톤(lactone)링으로 구성된다. 대부분의 매크로라이드계는 약한 염기성을 띄며 산에서 매우 불안정 한 것으로 알려져 있다(^{Hou et al., 2015}). 아미노글리코사이 드계(aminoglycosides) 항생제 또한 염기성을 띄고 친수성이 강해 수용해도가 높으며 광분해 되기 쉽다(^{Thiele-Bruhn, 2003}). 베타-락탐(β-lactam)계는 페니실린(penicillin)계열과 세팔로스포린계열을 포함하는데 베타-락탐 링은 산성과 염 기성 매체에서 쉽게 분리되는 특징을 갖는다(^{Thiele-Bruhn, 2003}). 카르복실폴리에테르(carboxylic polyether)를 백본(backbone) 으로 하는 이오노포어 폴리에테르(ionophore polyether) 계열은 양이온 결합하여 가상의 메크로사이클릭 착물을 형 성하는 특성을 갖는다(^{Volmer and Lock, 1998}).

이러한 화학적 특성으로 인해 항생제에 따른 효과적인 전처리 방법이 다를 수 있고, 따라서 본 논문에서는 각 항 생물질에 따른 효과적인 전처리 방법을 확인하고자 하였으 며 다양한 종의 항생물질을 동시에 분석 가능하도록 하는 전처리 방안을 찾고자 하였다. EPA method 1694 분석방법 을 우선 고려하였으며, 선정한 모든 물질들에 대한 분석방 법을 검토할 목적으로 EPA method 1694에 제시되지 않은 물질들에 대해서는 문헌조사를 통해 분석방법을 검토하였 다. 고체 시료에 포함된 잔류항생제를 분석한 연구를 대상 으로 하였고, 고체 시료로는 동물과 생선의 조직이나 계란 등의 식품, 동물의 사료, 자연시료인 토양, 퇴적물, 비료와 가축의 생 분뇨를 대상으로 검토하였다.

3. Pre-treatment Methods of Solid Samples

대표적인 고체 시료인 동물 조직(tissue)은 단백질과 지질 을 다량 함유하고 있기 때문에 동물의 근육, 간, 콩팥 등에 포함된 항생제를 분석하기 위해서는 적절하고 충분한 정제 과정을 적용할 필요가 있다. 또한 분뇨, 비료 등의 고체 시 료도 단백질을 포함 하는 성상이 복잡한 고체 시료이기 때 문에 정확한 분석을 위해서는 적절한 전처리 단계의 선정 및 개발이 중요하다. 특히, 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)와 질량분석기(mass spectrometry, MS)를 이 용한 분석을 위해서는 시료의 전처리 단계가 매우 중요하 며 전처리 방법의 핵심 목적은 분석 대상 물질의 농도를 고농도로 농축하고 여타 방해물질을 제거하는데 있다. 일반 적으로 고체 시료의 전처리 방법은 시료중의 항생제를 액 체상으로 추출해 내기 위한 추출 과정(extraction)과 항생제 가 추출된 추출액에서 불순물과 간섭물질들을 제거하고 고 성능액체크로마토그래피에 주입할 수 있는 상태로 시료를 제조하는 정제(clean-up) 과정을 거친다(Fig. 4).

Fig. 4. Schema of a basic concept and common methods for sample preparation of solid samples.

고체 시료에 포함된 항생제를 추출하는 방법으로는 크게 액-액추출법(liquid-liquid extraction; LLE)과 고상추출법(solidphase extraction, SPE)으로 나뉜다. 전통적인 액-액추출법의 효율을 높이기 위한 목적으로 기계적인 교반(^{Kim and Carlson, 2007}; ^{Lopes et al., 2012}; ^{Schlusener et al., 2006}), 초음파 (^{Boscher et al., 2010}; ^{Gorissen et al., 2015}; ^{Ho et al., 2012}; ^{Zhou et al., 2012}), 가압용매추출법(pressurized liquid extraction)(^{Bak et al., 2013}; ^{Carretero et al., 2008}; ^{Messi et al., 2005}) 등의 방법이 사용된다. 압력과 온도를 조절하 고 초임계유체(supercritical fluid)의 용해력 변화를 통해 용 질을 추출·분리하는 초임계유체추출법(supercritical fluid extraction)이 고체 시료에 적용이 가능하나 자연물질로부터 정유(精油, essential oil)를 추출하는데 주로 사용되며(^{Lang and Wai, 2001}; ^{Reverchon and De Marco, 2006}) 항생제 추출에는 거의 적용되지 않는 것으로 나타났다. 고상추출법 에서는 주로 상용화된 카트리지를 적용하여 추출을 수행하 며 항생제 분석을 위한 전처리 과정에서 가장 많이 사용되 는 방법 중 하나이다. 그러나 고체 시료의 전처리 과정에 서는 용매를 이용하여 고체 시료로부터 대상 물질을 추출 한 후 농축 및 정제의 목적으로 고상추출법이 적용되며(^{Ho et al., 2012}; ^{Kaufmann et al., 2012}) 정제과정으로 분리막 여과나(^{Bousova et al., 2013}; ^{Gorissen et al., 2015}; ^{Kaklamanos et al., 2013}; ^{Lopes et al., 2012}) 둘 이상의 카트리 지를 연속 결합한 고상추출법을 적용하기도 한다(^{Hong et al., 2015}; ^{Zhou et al., 2012}). 고체 시료로부터 직접 물질 을 추출하는 방법으로 대상 시료와 고상 흡착물질을 혼합 하여 균질화한 후 추출을 수행하는 시료고체상분산(matrix solid phase dispersion)을 사용하기도 하는데 식품 중의 독 성물질이나 단일계열의 항생제를 추출하는데 주로 사용되 며 다계열 항생제 분석을 위한 전처리로 사용되는 경우는 극히 드문 것으로 나타났다(^{Barker, 2007}; ^{Capriotti et al., 2010}). 농약과 살충제를 효과적으로 분석할 목적으로 시료 고체상분산법을 개량하여 2003년 미국농무부(U. S. Department of Agriculture, USDA)에서 개발한 QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)방법(^{Anastassiades et al., 2003})은 지속적인 연구가 진행되어 다양한 분석 용 키트(kit)가 개발되어 사용되고 있으며 고체나 점도가 높 은 액체(우유, 꿀 등) 식품으로부터 항생제를 추출하기 위한 전처리 기법으로 그 적용 분야가 확대되고 있다(^{Amelin et al., 2015}; ^{Shendy et al., 2016}; ^{Stubbings and Bigwood, 2009}).

추출과정에서는 제단백(deproteinization)이 필요하며 동물용 항생제 추출을 보고한 대부분의 문헌은 과염소산(perchloric acid), 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA) 등의 유기산을 첨가하고 변성 침전된 단백질을 원심분리나 여과를 통해 제거하는 방법을 사용하는 것으로 나타났다(^{Bousova et al., 2013}; ^{Kaufmann et al., 2012}; ^{Tao et al., 2012}).

3.1. 아미노글리코사이드계 항생제 분석을 위한 고체 시료 전처리

앞서 언급한 바와 같이 유럽연합, 중국, 일본, 미국, 식품 첨가물 전문가위원회(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA) 등에서 식품 중의 아미노글리코사 이드계 항생제의 최대 허용 농도를 제시하고 있기 때문에 동물성 식품 중의 잔류 항생제 분석을 위한 많은 연구가 진행되었지만(^{Bousova et al., 2013}; ^{Kaufmann et al., 2012}; ^{Tao et al., 2012}; ^{Zhu et al., 2008}), 타 계열 항생제와 동 시 분석을 수행하거나 분뇨, 퇴비, 퇴적물 등 식품 이외의 매질에 대한 분석방법이나 전처리방법을 연구한 문헌은 제 한적이다. 따라서 아미노글리코사이드계열 항생제의 전처리 방법은 분류하여 Table 3에 정리하고 나머지 항생제의 전 처리 방법은 Table 4에 나타내었다.

Table 3. Extraction and clean-up method for the determination of aminoglycosides in solid samples (TCA: trichloroacetic acid; HFBA: heptafluorobutyric acid; ACN: acetonitrile)

고체 시료를 사용하는 모든 분석방법은 시료 균질화 과 정을 거친다. 잔류 항생물질의 추출을 위한 용매는 균질화 전 또는 후에 시료에 투입하며 균질화 과정을 거치면서 고 체 입자는 분자상으로까지 파쇄되어 용매와 접촉한다. 대부 분의 아미노글리코사이드 계열의 항생제는 균질화를 통한 추출방법을 적용하는 것으로 조사되었다(Table 3). 일반적 으로 동물 조직으로부터 항생제를 추출하는 과정에서 제단 백을 수행하는데, 시료 중에 단백질이 존재하는 경우 화학 반응을 방해하거나 거품 또는 혼탁을 일으켜 분석과정에 오차를 유발할 수 있기 때문이다. 과거의 연구에서 유기용 매인 아세토나이트릴(acetonitrile, ACN)을 사용하여 계란에 서 스트렙토마이신(streptomycin)을 72%의 회수율로 추출하 기도 하였으나(^{Kowalski et al., 1999}) 최근의 연구에서는 산을 주로 사용한다. 과염소산(^{Vinas et al., 2007})이나 포름 산(formic acid)(^{Heller et al., 2000})을 사용한 연구도 보고 되고 있으나 아미노글리코사이드계열의 항생제를 분석한 최근의 연구들은 트리클로로아세트산을 주로 사용하는 것 으로 나타났다. 첨가된 트리클로로아세트산은 음이온으로 해리되고 단백질과 결합하여 침전물을 형성하는 것으로 알 려져 있다. 또한 ^{Kaufmann and Maden (2005)}은 최적화된 농도인 5%에서 만족할 만한 회수율을 나타내는 것으로 보 고하였다. ^{Kaufmann and Maden (2005)}의 연구에 따르면 2% 이하의 농도(0.1, 1, 2%)에서는 탁도를 갖는 추출액이 생성되고 이는 정제과정에 어려움을 줄 뿐만 아니라 회수 율도 감소하는 것으로 나타났다. 또한 10%의 트리클로로아 세트산을 적용하였을 때 회수율은 가장 높았으나 높은 이 온세기로 인해 고상추출단계에서 부정적인 효과를 나타내 고 질량분석기에서 높은 이온억제(ion suppression)현상이 나타날 수 있다고 하였다.

추출된 액상시료는 고상추출법을 통해 정제과정을 거치 는데 주로 약한 양이온교환 카트리지(weak cation exchanger) 가 사용되며(^{Chen et al., 2010}; ^{Cherlet et al., 2007}; ^{Ishii et al., 2008}; ^{Van Holthoon et al., 2009}) 이온교환 카트리 지는 분자의 이온화형태에 따라 결합·분리 여부가 결정되기 때문에 적재시료의 pH 조절이 매우 중요하다(^{Kaufmann et al., 2012}). 조사 결과 시료의 pH는 약산성 또는 약염기성 인 5.5~8.5 범위에서 결정되는 것으로 나타났다. ^{Tao et al. (2012)}은 자동화 고상추출시스템인 Gilson Aspec XL4 automated SPE system(carboxy propyl phase(CBA))으로 아미노 글리코사이드계 항생제 분석을 위한 시료를 처리하였는데 pH 6.5이하, 8.5이상에서 급격한 회수율 감소를 확인하였고 7.5를 최적 조건으로 제시하기도 하였다(Table 3).

3.2. 콜리스틴 분석을 위한 고체시료 전처리

콜리스틴은 콜리스틴 A, 콜리스틴 B(두 물질이 약 85% 를 구성함)를 포함하여 30종 이상의 유사구조를 갖는 폴리 펩티드(polypeptide) 분자의 혼합물이다(^{Elverdam et al., 1981}; ^{Orwa et al., 2001}). 이러한 화학적 특성으로 인해 정 확한 정량이 어렵고 특히, 매질이 복잡한 생물학적 시료(분 뇨 포함)를 대상으로 콜리스틴을 분석한 문헌은 극히 드물 게 보고되고 있으나 염산으로 처리한 후 고상추출법을 적 용하는 것으로 나타났다(Table 4). 염산으로 처리하는 경우 산 가수분해로 지방질 제거와 단백질 입자의 석출이 일어 나고 결과적으로 회수율이 향상된다고 보고되고 있다 (^{Wan et al., 2006}; ^{Xu et al., 2012}).

Table 4. Extraction and clean-up method for pre-treatment of the other solid samples (TCA: trichloroacetic acid; HFBA: heptafluorobutyric acid; PLE: pressurized liquid extraction; PSA: primary secondary amine; FA: formic acid; DCM: dichloromethane; ACN: acetonitrile)

4. Conclusions

가축분뇨실태조사 항목인 항생제 분석을 성공적으로 수 행하기 위하여 본 연구에서는 국내에 판매된 축산용 항생 제 판매량을 조사하여 37종의 대상 물질을 선정하고 가축 분뇨 중의 대상 항생제 잔류량을 분석하기 위해 필요한 전 처리 방법을 확인하고자 고상시료를 대상으로 전처리 방법 을 연구한 문헌을 조사, 다음과 같은 결론을 도출하였다.

일반적으로 고상시료의 추출방법으로 기계적인 혼합법, 초음파추출법, 가압용매추출법 등을 적용하며 추출액은 분 리막 여과나 고상추출법을 통해 정제되는 것으로 조사되었 다. 아미노글리코사이드 계열의 항생제에 대한 연구는 주로 동물의 신체나 어류를 대상 시료로 하고 있어 추출과정에 서 5% 트리클로로아세트산용액을 사용하여 단백질을 제거 하고, 콜리스틴은 염산을 이용해 지방질과 단백질을 제거하 여 높은 회수율을 얻을 수 있는 것으로 보고되었다. 이를 제외한 물질들은 주로 아세토나이트릴과 메탄올을 혼합용 매로 사용하며 초음파추출법을 많이 적용하는 것으로 나타 났다. 일부 문헌에서 가압용매추출법을 적용하고 있으며 추 출용매의 온도와 종류에 따른 추출효율을 평가하기도 하였 으나 분석대상물질의 특성에 따라 최적 조건이 다르게 나 타나 가압용매추출법을 적용하기 위해서는 대상 시료를 바 탕으로 조건의 최적화가 선행되어야 한다. 대부분의 항생물 질은 산성시료 조건에서 전처리를 수행하며 추출 또는 정 제과정에서 pH는 2.0~4.0 범위로 조절하는 것으로 나타났 으나 아미노글리코사이드 계열과 베타-락탐 계열의 항생제 는 중성 pH 조건에서 전처리를 수행하는 것으로 조사되었 다. 이는 항생제의 화학적 특성에 기인한 것으로 고상추출 법을 적용하는 액체시료의 전처리에서도 동일한 원리를 이 용하여 시료의 pH를 결정하는 것으로 판단되었다. 정제를 위한 여과는 0.2 μm의 공극크기를 갖는 분리막을 주로 사 용하는 것으로 조사되었고, Oasis HLB 카트리지와 메탄올 을 사용한 고상추출법이 가장 많이 적용되고 있는 것으로 나타났다.

고상시료는 고농도의 단백질 및 유기물을 함유하고 있기 때문에 정확한 분석을 위해서는 적절한 추출과 정제과정의 전처리 방법을 적용해야 하며 전처리 효율은 분석대상물질 의 화학적 특성에 따라 상이하게 나타난다. 본 연구에서 선정한 37종의 대상물질을 분석하기 위해 고체 시료의 전 처리를 수행하는 경우 아미노글리코사이드계와 베타-락탐 계 항생제를 측정하기 위한 별도의 전처리가 수행되어야 한다. 즉, 최소 3가지의 전처리 과정을 적용해야 할 것으로 판단된다.