2.1. 균주 분리 및 배양 조건

연구에 사용된 균주 Aphanizomenon flos-aquae (DaeGu University Cyanophyceae, DGUC; 자원 번호: DGUC003)는 2016년 10월 삼랑진교 지점에서 채수하여 분리하였으며 (Fig. 1), 균주의 계통학적 및 독성유전학적 특징은 선행연 구에 제공되어 있다(^{Ryu et al., 2017}). 타감 작용 실험에 사용된 균주 Microcystis aeruginosa (자원 번호: DGUC007) 와 Aulacoseria ambigua f. spiralis (자원 번호: DGUD001) 는 낙동강 남지교 지점, Aphanizomenon flos-aquae (자원 번호: DGUC001)은 낙동강 적포교 지점의 시료에서 각각 분 리하였으며, Scenedesmus obliquus (자원 번호: FBCC110011) 는 국립낙동강생물자원관 생물자원은행에서 제공받았다(Table 1).

Fig. 1. Photographs of strains isolated from the Nakdong River; (a) fascicles ofAphanizomenon flos-aquae, (b) trichome ofAphanizomenon flos-aquae.

균주들은 100 mL의 CB medium (^{Shirai et al., 1989})과 DM medium (^{Beakes et al., 1988}), BG11 medium (^{Stanier et al., 1971})이 각각 담긴 250 mL Erlenmeyer flask에서 온 도 (20±2°C), 광주기 (12h^L:12h^D), 광조건 (60 μE m^-2 s^-1의 형광등)이 조절되는 진탕배양기 (Hanbaek, HB-201SLI) 안 에서 반연속식 배양방법으로 전배양 (pre-culture)하였다. 반 연속식 배양은 CB medium을 1주 간격으로 10%씩 교체하 였으며, 격월로 새로운 배지에 계대배양하여 수행하였다.

2.2. 온도 및 영양염에 따른 성장반응

성장반응 실험은 멸균된 CB medium이 담긴 250 mL Erlenmeyer flask에 전배양 (pre-culture)에서 대수증식기 (exponential phase)에 도달한 세포를 8.5 × 10³ cell mL^-1의 농도 가 되도록 접종한 후, 회분식 배양법으로 통제된 실험조건 하 에서 영양염과 온도 조건에 따라 진행하였다. 회분식 배양법 으로 인한 영양염 결핍 및 2차 대사산물의 영향을 배제하기 위하여, 배양 기간은 28일간 유지하였다 (^{Ma et al., 2015}). 영양염과 온도의 성장반응 실험의 경우, CB medium을 현 장조건에 맞게 영양염 농도가 조절된 배양액 (‘modified’ CB medium: 1.37 mg NO₃-N L^-1, 0.33 mg PO₄-P L^-1)과 질산염 (Ca(NO₃)₂4H₂O, KNO₃)이 결핍된 배양액 (N-depleted medium: 0.0 mg NO₃-N L^-1, 0.33 mg PO₄-P L^-1), 인산염 (β-Na₂glycerophosphate) 이 결핍된 배양액 (P-depleted_CB medium: 1.37 mg NO₃-N L^-1, 0.00 mg PO₄-P L^-1)의 영양염 3단계와 4, 12, 21, 30°C의 수온 4단계가 조합된 총 12가지 조건하에서 수 행하였다(Table 2). 현장조건에 맞게 조절된 영양염 농도는 2015년 낙동강 보 구간의 영양염 농도를 고려하여 제작하였 다 (^{NRERC, 2015}) (Table 3). 질산염과 인산염 결핍 배지는 실험에 사용된 균주가 독소 생성 균주일 경우, 영양염 제한 조건에서 높은 농도의 saxitoxin과 cylindrospermopsin을 생성 할 수 있다는 가설을 검증하기 위하여 수행되었다 (^{Casero et al., 2014}; ^{Dias et al., 2002}; ^{Preussel et al., 2014}). 앞서 설명한 배양조건을 유지하며, 격일 간격으로 3 mL씩 채수 하여 3회 계수하였다. 비성장률은 시간에 따른 생물량의 변화로 산출하였으며, 여기서 X₀, X_Δt는 초기와 t 시간 후 의 세포수 (cells mL^-1)를 의미하며, Δt는 기간 (day)을 의 미한다.

온도 조건에 따른 성장률의 추정은 ^{Jöhnk et al. (2008)}의 방법으로 수행하였으며, 여기서 μ(T)는 T온도에서 비성장 률, μ_max는 최적 온도 T_opt에서 최대성장률, b_i, R_1i, R_2i는 최 적성장곡선의 형태를 통해 제시한 변수들이다 (^{Jöhnk et al., 2008}).

2.3. ELISA에 의한 Saxitoxin과 Cylindrospermopsin 분석

성장반응 실험이 종료된 12개 시료의 배양액과 조체를 사 용하여, Aphanizomenon flos-aquae (자원번호: DGUC003) 균주의 saxitoxin (STX)과 cylindrospermopsin (CYN) 존재여 부와 농도를 측정하였다. 독소 분석은 배양액에 용해된 용존 성 독소 물질과 균주 조체 내 함유되어 있는 입자상 독소 물질을 구분하여 진행하였다. 분석은 Saxitoxin과 Cylindrospermopsin 검출이 가능한 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) (Abraxis LLC, USA)를 적용하였다. 실험에는 Saxitoxins/Lyngbyatoxin kit와 Cylindrospermopsin kit가 사용 되었으며, 이 중 Saxitoxins/Lyngbyatoxin kit는 neosaxitoxin 과 decarbamoylsaxitoxin에 대해서도 상호작용을 보여 검출 이 가능하다 (^{Cirés et al., 2014}). 200 mL의 시료를 GF/C 필터 (Whatman, UK)를 사용하여 여과하였으며, 필터와 여 과액을 구분하여 -20°C에서 보관하였다. 필터는 추출 후 30분 간 얼음이 담긴 비커에 tube를 고정하여 초음파 파쇄 되었고, 입자상 추출물과 용존성 여과액은 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 모든 기준 용액과 시료는 설명서 의 지침에 따라 적용하였으며, 3회 반복하여 실험을 수행 하였다. 흡광도는 분광광도계 (Shimadzu Co., Japan)를 이 용하여 450 nm에서 측정하였다. 본 분석의 검량 한계선은 0.04 μg L^-1이다. 총 STX와 CYN의 농도는 입자상 농도와 용존성 농도의 합으로 산출하였다.

2.4. 타감 작용

Aphanizomenon flos-aquae (자원번호: DGUC003) 균주는 사전 실험과 동일한 온도 및 광도 조건하의 CB 포화 배지 (‘full’ CB medium)에서 배양되었으며, 세포의 용해가 발생 하여 타감 물질의 농도가 가장 높을 것으로 예상되는 지수 성장단계의 말기에 수확되었다 (^{de Figueiredo et al., 2011}; ^{Rapala and Sivonen, 1998}). 낙동강에서 출현하는 주요 규조 류 및 남조류, 녹조류의 성장에 Aphanizomenon flos-aquae 여과액이 미치는 저해 효과를 평가하기 위하여, 낙동강에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae (자원번호: DGUC001), Microcystis aeruginosa (자원번호: DGUC007)와 Aulacoseria ambigua f. spiralis (자원번호: DGUD001), Scenedesmus obliquus (자원번호: FBCC110011)가 사용되었다. 각 균주 는 사전 실험에서 사용된 동일 배지에서 실험이 진행되었 으며, 배양 조건은 온도 (20±2 °C), 광주기 (12h^L:12h^D), 광조 건 (60 μE m^-2 s^-1의 형광등) 등으로 유지되었다 (^{de Figueiredo et al., 2004}; ^{Gonçalves et al., 2005}). 용해된 균주의 산물 이 포함된 배양액은 Whatman GF/C 필터를 통해 여과 후 에 획득되었으며, 균주 접종 후에 진탕배양기에서 96시간 동안 노출되었다. 타감 작용의 효과는 비성장률을 이용하여 정량화 하였으며, 실험군과 대조군별로 각 균주의 세포수를 산출하였다. 실험군은 40% 추출액에 60%의 각 medium을 추가하여 수행되었으며, 대조군은 40% 증류수에 60%의 각 medium을 추가하였다. 250 mL Erlenmeyer 플라스크에 최 종 실험 용액 100 mL을 주입한 후 총 3회에 걸쳐 반복 수 행하였다.

2.5. 통계 분석

모든 통계 자료 분석은 SPSS v.18.0에서 수행되었다. 성장 반응에 사용된 다양한 조건의 처리군 간에 유의미한 차이를 분석하기 위하여 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용하였으며, 사후 다중비교검정 (post-hoc multiple comparison) 은 Tukey HSD test 방식으로 검정하였다. 한편, 독 립 t-test를 사용하여 여과액에 의한 조류별 성장 저해 실험 에서 대조군과 실험군 간에 유의미한 차이를 분석하였으며, 모든 통계 분석은 p<0.05 수준에서 유의미한 값으로 간주 하였다.

3.1. 온도 및 영양염에 따른 성장반응

Aphanizomenon flos-aquae는 일반적으로 23-29°C의 수온 을 선호하며, 다른 남조류에 비하여 저온에 높은 내성을 갖는 것으로 알려져 있다 (^{üveges et al., 2012}; ^{Yamamoto, 2009}). 낙동강에서 Aphanizomenon flos-aquae는 2012년 이 후 연중 출현하고 있으며, 특히 동절기에 우점분류군으로 나타나고 있다 (^{Park et al., 2015}; ^{Yu et al., 2014}). 낙동강 에서 연중 출현하는 Aphanizomenon flos-aquae의 성장반응 을 확인하기 위하여 현장조건의 영양염 농도에 맞게 보정 된 ‘modified’ CB medium에서 수온별로 분석한 결과, 세 포밀도는 21°C에서 581,700 cells mL^-1로 가장 높게 나타났 고, 30°C의 수온에서보다 12°C의 수온에서 오히려 높은 세 포밀도를 보였다. 반면 4°C에서는 세포밀도의 뚜렷한 변화 가 관찰되지 않았다 (Fig. 1(A)). ‘modified’ CB medium에 서 Aphanizomenon flos-aquae의 성장은 온도에 따라 유의 미한 차이를 보였으며 (F = 12.24, p<0.01), 특히 21°C에서 다른 온도와 통계적으로 구분되는 특징을 보였다.

영양염 조건별 실험에서 질소 결핍 N-depleted CB medium 에서는 4°C를 제외한 모든 온도 조건에 따른 유의미한 Aphanizomenon flos-aquae의 성장이 관찰되었으나, 질소가 공급된 modified CB medium에서의 성장보다는 성장률이 낮았으며(μ = 0.09-0.14 day^-1), 최대 세포밀도에서도 385,800 cells mL-1로 적은 양을 나타내었다 (Fig. 1(B)). Nostocales의 Aphanizomenon flos-aquae는 질소원으로 N₂ 고정세포인 heterocyte를 이용할 수 있지만, 수중에 결합된 질소를 우선적 으로 섭취한다. 이는 heterocyte 세포 형성 및 N₂ 고정에 사 용에 필요한 에너지가 증가되기 때문이다 (^{Cirés and Ballot, 2016}). 질소가 제한된 실험실 조건에서의 Aphanizomenon flos-aquae의 성장은 대사과정에 영향을 받았을 것으로 추 정되며, 결과적으로 질소가 공급된 조건에서의 성장 속도 및 세포밀도에서 차이가 유발된 것으로 판단된다. 이러한 결과는 Aphanizomenon flos-aquae의 성장에서 성장 배지에 함유된 질소 이용가능성과 양의 상관성을 보이는 사전 연 구결과와도 일치하였다 (^{Preßel et al., 2009}; ^{Preussel et al., 2014}). 인 결핍 P-depleted CB medium에서 균주는 거의 성 장하지 않았으며 (μ = 0.04-0.05 day^-1), 온도 조건에 따른 균주 의 성장에는 유의미한 차이가 없었다 (F = 2.15, p>0.05). 이 를 통해 인 결핍 조건에서는 온도에 상관없이 Aphanizomenon flos-aquae의 증식이 제한될 수 있음을 확인하였으며, 이와 유사한 현상은 실험실 조건에서 수행된 선행 연구에서도 확 인할 수 있었다 (Fig. 1(C)) (^{de Figueiredo et al., 2004}; ^{de Figueiredo et al., 2011}). 한편, Aphanizomenon flos-aquae의 성장은 질산염 (F = 6.56, p<0.05)과 인산염 (F = 76.33, p<0.01)의 각 조건에 대해 유의미한 차이를 보였다.

Aphanizomenon flos-aquae의 비성장률은 4 °C에서 0.04-0.10 day^-1, 12°C에서 0.05-0.15 day^-1, 21 °C에서 0.05-0.17 day^-1, 30°C에서 0.04-0.13 day^-1의 범위로 나타났으며, 최대성장률 (μ_max)은 0.17 day^-1로 나타났다. 이러한 성장률의 범위는 녹 조현상 유발 분류군인 Microcystis aeruginosa의 성장률 (μ = 0.80 day^-1)보다는 비교적 낮지만 (^{Jöhnk et al., 2008}), Israel, Kinneret 호와 같은 자연 생태계 (^{Pollingher et al., 1998})나 제한된 특정 실험실 조건 (^{Preßel et al., 2009})에서 측정된 Aphanizomenon 분류군의 성장률 (μ=0.09-0.20 day^-1) 과는 유사한 범위에 해당되었다 (^{Mehnert et al., 2010}). 한 편 ^{Jöhnk et al. (2008)}의 방법을 이용하여 수온에 따른 성 장조건을 추정한 결과, 영양염 조건에 따라 Aphanizomenon flos-aquae의 성장가능 온도범위는 -0.3-34.3°C로 확인되었 으며, 최적성장온도 (T_opt)는 18.3-21.2 °C(19.9°C)로 나타났 다 (Fig. 2). 낙동강에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae 균주의 최적성장온도 (T_opt)은 Germany, Stechlin호에서 분 리된 Aphanizomenon flos-aquae (ST86AF) 균주의 최적성장 온도(T_opt) 24.7°C와 차이를 보였다 (^{Mehnert et al., 2010}). 이러한 결과는 최근 낙동강의 저수온기에 높은 세포밀도로 출현하는 Aphanizomenon 속의 생태학적 현상을 반영하고 있는 것으로 판단되었다 (^{Yu et al, 2014}).

Fig. 2. Growth response ofAphanizomenon flos-aquaeinoculated to the medium with different nutrients (a: 1.33 mgNO3-N L-1, 0.33 mgPO4-P L-1, b: 0.0 mgNO3-N L-1, 0.33 mgPO4-P L-1, c: 1.33 mgNO3-N L-1, 0.0 mgPO4-P L-1) and cultured at four different temperatures (4 and 12, 21, 30°C). Results shown are the means (±S.D.) of three replicates.

3.2. 독소 생성 분석

독소 생합성의 유전학적 및 생리학적 특성이 대부분 밝혀 진 Microcystis aeruginosa나 Cylindrospermopsis raciborskii 등의 독소 생성 분류군은 독소 생성과 성장률 간에 나타나는 뚜렷한 상관성이 많은 연구를 통해서 보고되어왔지만 (^{Orr and Jones, 1998}; ^{Pierangelini et al., 2015}), Aphanizomenon flos-aquae는 최근까지 보고된 많은 연구에서도 독소 생성과 성장률 간의 분명한 상관성이 확인되지 않았다 (^{Casero et al., 2014}; ^{Cirés et al., 2014}). 게다가 독소 분류군에 의한 독 소 생성량은 균주-의존적이라는 보고가 있다 (^{Chonudomkul et al., 2004}). 또한 Aphanizomenon flos-aquae의 독소 생성 은 형태학적 및 계통학적으로 순수 분리된 균주에 의해 입 증되지 않았기 때문에, 아직까지 논쟁의 여지가 남아 있다 (^{Cirés and Ballot, 2016}). 이를 확인하기 위해 낙동강 현장시 료에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae의 2개 균주를 대상 으로 ELISA 분석을 실시한 결과, 성장 반응에 따른 모든 배 양 실험의 세포 조체와 배양액 내에서 cylindrospermopsin 과 saxitoxin의 독소는 검출되지 않았다. 또한, saxitoxin의 변이체인 neosaxitoxin과 decarbamoylsaxitoxin에 대해서도 ELISA 분석에서 반응이 나타나지 않았다 (검출한계 0.04 μgL^-1).

따라서 낙동강에서 분리된 Aphanizomenon flos-aquae의 2 개 균주는 모두 cylindrospermopsin과 saxitoxin을 생성하지 못하는 비독성 균주로 판단되었다. 다만 Aphanizomenon 속 의 분류군 중 Aphanizomenon gracile와 Chrysosporum ovalisporum, Cuspidothrix issatschenkoi와 같이 독소 생성 능이 입증된 분류군이 있으며 (^{Ballot, Fastner et al., 2010}; ^{Casero et al., 2014}; ^{Cirés and Ballot, 2016}), 동일한 분류 군 내에서도 독소 생성 균주와 비생성 균주가 공존할 수 있음으로 (^{Moustafa et al., 2009}), 낙동강에서 출현하는 모 든 Aphanizomenon flos-aquae를 비독성 균주로 간주하기 위해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.

3.3. 타감 작용 평가

Nostocales 목에 속하는 남조류 균주 배양 여과액은 식물 플랑크톤의 성장과 안정화를 저해하여 군집구조에 영향을 주며 (^{Suikkanen et al., 2005}), 이는 독소와 같은 2차 대사 산물이 경쟁자의 성장저해 및 종간상호작용에 관여하는 다 양한 종류의 상호대립억제작용물질 (allelochemicals)로서 작 용하기 때문이다 (^{Berry et al., 2008}; ^{Leão et al., 2009}). 본 연구에서 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC003) 균주의 배 양 여과액이 미치는 성장저해 효과가 녹조강인 Scenedesmus obliquus (FBCC110011)와 남조강인 Microcystis aeruginosa (DGUC007)을 대상으로 진행된 실험에서는 관찰되지 않았 지만, 규조강인 Aulacoseira ambigua f. spiralis (DGUD001) 를 통한 실험에서는 대조군과 비교하여 실험군에서 세포수 의 28% 감소되는 유의미한 타감효과가 관찰되었다. 또한 동일종인 Aphanizomenon flos-aquae (DGUC001) 균주를 대 상으로 한 실험에서도 19%의 유의미한 성장저해 효과가 나 타났다 (Table 4; Fig. 3). 이를 통해 독소와 같은 2차대사 산물을 생산하지 않는 비독성 Aphanizomenon flos-aquae 균 주에서도 타감 작용 및 자가 저해 현상이 유발될 수 있음이 확인되었다. 이러한 현상은 다른 남조류에서 발견된 chelators (^{Murphy et al., 1976}) 및 portoamides (^{Leão et al., 2010}) 등의 성장 억제제에 의한 영향이거나, Phormidium tenue 등 일부 사상형 남조류에서 발견된 자기분해 물질과 같은 화합 물에 의한 영향으로 추론되지만 (^{Murakami et al., 1990}), 정확한 원인물질 규명을 위해서는 향후 더 많은 연구가 필 요할 것으로 사료된다. (Fig. 4).

Fig. 3. Specific growth rates and growth curves ofAphanizomenon flos-aquaeinoculated to the medium with different nutrients (●: 1.33 mgNO3-N L-1, 0.33 mgPO4-P L-1, ▲: 0.0 mgNO3-N L-1, 0.33 mgPO4-P L-1, ■: 1.33 mgNO3-N L-1, 0.0 mgPO4-P L-1). Results shown are the means (±S.D.) of three replicates.

Fig. 4. Growth inhibition effect of (a)Scenedesmus obliquus, (b)Microcystis aeruginosa, (c)Aulacoseria ambiguaf.spiralis, (d)Aphanizomenon flos-aquaeby CB medium added toAphanizomenon flos-aquaefiltrate (solid square) or CB medium added to distilled water (blank square). Results shown are the means (±S.D.) of three replicates.