2.1. 중금속 용액 준비

중금속 독성 평가를 위해 CdSO₄·nH₂O (99%, Junsei Chemical Co., Japan)와 ZnSO₄ (101.69%, Mallinckrodt, Ireland)를 사용하여 Cd(12±0.87 mg L^-1)용액과 Zn 용액 (130±0.10 mg L^-1)을 준비하였다. 본 연구에 사용한 Cd용 액과 Zn 용액의 농도는 사전 실험을 통해 산출한 각각의 EC₅₀값을 기반으로 다양한 희석 배율로 물벼룩 독성 평가 를 수행할 때 EC₅₀값이 노출 농도 범위 내에 포함될 수 있 도록 설정하였다. 경도의 영향을 알아보기 위해 중금속 용 액의 경도를 100, 200, 300 mg L^-1 as CaCO₃로 조절하였 다. 경도 조절에는 MgSO₄, NaHCO₃, CaSO₄·2H₂O, KCl를 사용하였다. 혼합 중금속의 독성 평가를 위해 Cd 용액과 Zn 용액을 혼합하여 Cd:Zn의 부피 혼합비가 1:1, 1:2, 2:1(v/v)인 중금속 혼합액을 준비한 후, 경도를 조절하였다. 이 때 중금속 용액의 초기 pH는 평균 7.97±0.05으로, 실험 중 pH는 유지되었다.

2.2. 중금속 독성 실험

중금속 용액의 독성 평가를 위해 수질오염공정시험기준 [ES 04704.1a](^{MOE, 2017})에 준하여 D. magna를 배양하 여 사용하였다. 물벼룩의 배양을 위해 수온은 24±1°C로 유 지하였고, 빛 주기는 낮 16시간과 밤 8시간을 사용하였다. 독성 평가를 위한 시료는 각 중금속 용액과 혼합 용액을 1, 2, 4, 8, 16, 32배로 serial dilution하여 준비하였다. 이는 실험 대상 중금속 용액을 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125% 포함한 용액이다. 각 시료에 대한 독성 평가는 네 번 반복 수행하였고, 각 반복 실험당 다섯 마리의 물벼룩 개체를 사용하여 총 20마리의 물벼룩을 사용하였다. 중금속 노출 기간(24시간, 48시간) 동안 먹이는 공급하지 않았다. 각 중 금속의 독성 값으로는 24시간 또는 48시간 노출 후 얻은 반수유효농도(50% effective concentration, EC50)를 사용하 였다. 반복 실험을 통해 얻은 독성 값과 Dose-Response 곡 선으로부터 선형 보간법(Linear Interpolation)을 이용하여 물벼룩의 EC₅₀ 값을 산출하였고, 이 때 ToxCalc 5.0 프로 그램(Tidepoll Software, USA)을 사용하였다. 산출한 EC₅₀ 값은 toxic unit(TU; 100/EC₅₀)값으로 환산하였다.

2.3. 분석 방법 및 물벼룩 생태독성 정도 관리

독성 평가에 사용한 중금속 용액 내 Cd와 Zn 농도는 ICP-OES를 이용하여 두 번 반복 분석하였고, Cd와 Zn의 검출 한계는 각각 0.0004 mg L^-1와 0.0125 mg L^-1였다. 또 한 본 연구에서 수행한 물벼룩 독성 평가의 시험 생물인 물벼룩의 민감도와 시험 절차의 전반적인 신뢰성을 점검하 기 위해 매 시험마다 알려진 농도의 표준독성물질인 중크 롬산칼륨을 투입하여 동일한 반응 민감도가 나오는지 확인 하여 시험군에 문제가 없는지를 진단하고 분석의 신뢰성을 유지하였다.

3.1. 경도가 단일 중금속 독성에 미치는 영향

Fig. 1은 24시간과 48시간 노출 후 경도가 Cd와 Zn의 독 성 값에 미치는 영향을 보여준다. Cd의 경우 24시간 노출 후 EC₅₀ 값은 경도가 100 mg L^-1 as CaCO₃(약간 센물)에 서 300 mg L^-1 as CaCO₃(매우 센물)로 증가하면서 0.73에 서 10 mg L^-1로 크게 증가하였고, 이는 독성 영향이 감소 하였음을 의미한다(Fig. 1(a)). 48시간 후 Cd의 독성 영향은 24시간 후 독성 영향보다 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1(a)). TU값도 24시간 후보다 48시간 후 증가하여, 독성이 증가하였음을 보여주었다(Fig. 1(b)). Zn의 경우, 24시간 노 출 후 EC₅₀ 값은 경도가 100에서 300 mg L^-1 as CaCO₃로 증가하면서 5.7에서 25 mg L^-1로 증가하여 독성 영향이 감 소함을 알 수 있었다(Fig. 1(c)). Cd와 마찬가지로 Zn의 48 시간 노출 후 EC₅₀ 값은 경도가 100 mg L^-1 as CaCO₃일 때를 제외하고 24시간 노출 후 EC₅₀ 값에 비해 낮았고, 이 는 시간이 지나면서 Zn의 독성 영향이 증가하였음을 나타 낸다(Fig. 1(c)). Zn의 TU값도 같은 경향을 보였다(Fig. 11(d)). 이렇게 경도가 증가함에 따라 독성이 저감하는 것은 경도를 조절하기 위해 중금속 용액에 넣은 Ca²⁺와 Mg²⁺ 같 은 경도 유발 양이온이 Cd와 Zn같은 중금속과 경쟁하여 나타난 현상이라고 볼 수 있다(^{Pascoe et al., 1986}; ^{Di Toro et al., 2001}).

Fig. 1. Toxic effects of cadmium (Cd) (10 mg L-1) expressed (a) in 50% effective concentration (EC50) and (b) in toxic unit (TU) and toxic effects of zinc (Zn) (100 mg L-1) expressed (c) in EC50 and (d) in TU onDaphnia magnaafter 24 h and 48 h exposures. One toxicity value was calculated for each condition from the data obtained from the toxicity bioassay (four replicates) using ToxCalc 5.0.

경도가 100에서 300 mg L^-1 as CaCO₃로 증가했을 때 24 시간 노출 후 TU값의 변화는 Cd가 93%, Zn가 77% 정도 로 Cd가 더 민감하게 변했다. 또한, Zn의 경우 24시간 노 출 후 TU값 변화(77%)가 48시간 노출 후 변화(34%)보다 컸다(Fig. 1(d)). 독성 실험에 사용한 Cd용액의 농도가 Zn 용액의 농도에 비해 10배 낮음에도 불구하고, TU값이 비슷 하거나 조금 낮은 편인 것은 물벼룩이 Cd 독성에 더 민감 함을 의미한다고 볼 수 있다. 마찬가지로 물벼룩에 대한 Cd와 Zn의 만성 독성에 대한 연구에서도 Zn에 비해 Cd의 독성이 더 높다고 보고한 바 있다(^{Perez and Hoang, 2017}). Cd와 Zn의 TU값은 모두 경도와 강한 선형 관계(R² = 0.934 - 0.999)를 보였다(Table 1). 이와 비슷하게 기존 연구 에서도 물의 경도와 어류에 대한 Cd와 Zn의 EC₅₀값이 강 한 선형 관계를 보인바 있다(^{Mebane et al., 2012}). Cd의 경우 노출 시간의 증가는 경도에 대한 Cd의 독성 영향의 민감한 정도, 즉, 경도 변화에 따른 TU값 변화의 기울기에 큰 영향을 미치지 않았으나, Zn의 경우 48시간 후 기울기 가 24시간 후 기울기의 약 33%로 감소하여, 시간에 따라 경도가 물벼룩에 대한 Zn의 독성 영향 저감에 미치는 영향 이 감소하였음을 알 수 있다(Table 1). 이는 물벼룩 내 축 적된 Zn와 경도를 유발하는 Ca²⁺와 Mg²⁺ 같은 양이온의 양의 변화에 의한 것으로 볼 수 있다. 기존 연구에서 물벼 룩이 장기간 Zn에 노출되었을 때 물벼룩 내 Zn 함량은 증 가하고, Ca 함량은 감소함을 보여주어 Ca²⁺와 Zn가 경쟁 관계에 있음을 보고하였고, 또한, 물벼룩이 Zn에 노출되면 서 물벼룩 내 Ca²⁺의 밸런스가 영향을 받아 독성 영향이 발현된다는 가설을 보고한 바 있다(^{Muyssen et al., 2006}). 따라서 경도가 물벼룩에 대한 중금속의 독성 영향에 미치 는 영향에 대한 연구는 단기적 영향뿐 아니라 장기적 영향 에 대한 연구도 필요할 것으로 보인다.

3.2. 중금속의 혼합비와 경도가 혼합 중금속 독성에 미치는 영향

Fig. 2는 Zn와 Cd 혼합액이 물벼룩에 미치는 영향을 나 타내는 용량반응곡선을 보여준다. 전반적으로 경도가 증가 함에 따라 용량반응곡선의 기울기가 완만해지는 것을 볼 수 있다(Fig. 2). Fig. 3은 경도가 Zn와 Cd 혼합액의 TU값 에 미치는 영향을 보여준다. 경도가 중금속 혼합액의 TU값 에 미치는 영향은 단일 중금속의 TU값에 미치는 영향보다 명확하진 않았지만, 경도가 증가할수록 독성 값이 감소하는 추세를 보였다(Fig. 3). 또한, 노출 시간이 24시간에서 48시 간으로 증가하면서 독성 값이 증가하는 경향을 보였다(Fig. 3). 혼합비가 1:1인 용액(Fig. 3a)과 2:1인 용액(Fig. 3c)의 독성 값보다 혼합비가 1:2인 용액(Fig. 3b)의 독성 값이 상 대적으로 높은 경향을 보였다. 또한 경도가 100에서 300 mg L^-1 as CaCO₃로 증가했을 때 독성 영향이 저감하는 정도는 혼합비가 1:1 또는 2:1일 때보다 1:2인 용액에서 컸다 - 혼합비가 1:1 또는 2:1일 때 24시간 노출 후 독성 값은 각각 67%와 35% 감소하였으나, 1:2일 때는 87% 감 소하였다.

Fig. 2. Dose-response curves of the cadmium (10 mg L-1) and zinc (100 mg L-1) mixtures at hardness of (a) 100, (b) 200, and (c) 300 mg L-1as CaCO3. The toxicity to Daphnia magna after 24 h exposure to mixtures of Cd and Zn at mixing ratios (v/v) of 1:1, 1:2, and 2:1 is shown.

Fig. 3. Effect of hardness on toxicity toDaphnia magnaafter 24 h and 48 h exposures to mixtures of cadmium (10 mg L-1) and zinc (100 mg L-1) at mixing ratios (v/v) of (a) 1:1, (b) 1:2, and (c) 2:1.

TU값이 1일 때의 중금속 농도가 EC₅₀값인 것을 이용해 Cd와 Zn의 혼합액 내 중금속의 농도를 각 중금속의 EC₅₀ 값의 비율로 나타내고, 그 혼합물의 TU값은 각 중금속의 비율의 합으로 구하여, 중금속 혼합액의 예측 독성 값을 구하여 측정 독성 값과 비교하였다(^{Franklin et al., 2002}; ^{Mebane et al., 2012}) (Table 2). 단일 중금속의 EC₅₀값을 기반으로 예측한 혼합액의 독성 값은 실제 측정한 혼합액 독성 값보다 3.6 ± 1.8배 높았다(Table 2). 이렇게 예측 값보 다 낮은 측정 독성 값은 길항 작용에 의한 것으로 볼 수 있다. 기존 연구들은 Cd와 Zn의 혼합액이 물벼룩 및 다른 민물 생물에 미치는 독성 영향에 대해 상가 효과와 비상가 적 효과(길항효과 및 상승효과)를 보고하였고, 상가효과보다 는 비상가적 효과를 보고한 연구의 비율이 더 높다(^{Vijver et al., 2011}). 최근 Cd와 Zn의 혼합액 내 치사량에 가까운 Zn의 농도가 존재할 때 물벼룩을 Cd의 독성 영향으로부터 보호할 수 있음이 보고된 바 있다(^{Perez and Hoang, 2017}). Cd와 Zn의 중금속 혼합액에서 Zn 농도 증가에 의한 독성 변화는 Cd 농도 증가에 의한 독성 변화보다 컸다(Table 2). 부피 혼합비가 1:1에서 1:2로 증가하면서 혼합액 내 Zn 농 도가 증가하였고, 독성 영향이 증가하였다. 또한, 기존 연 구에서 물벼룩이 Zn을 섭취하는 정도는 Cd 농도가 증가할 수록 감소하는 경향을 보임을 보고하였다(^{Komjarova and Blust, 2008}). 이는 부피 혼합비가 1:1에서 2:1로 변하면서 혼합액 내 Cd 농도가 증가하여 Zn의 섭취를 저해하여 부 피 혼합비가 1:1일 때와 비슷한 독성 영향을 보이는 것을 뒷받침 할 수 있다. Fig. 4는 예측한 독성 값과 측정한 독 성 값 간의 관계를 보여준다. Cd와 Zn의 부피 혼합비가 1:1인 경우 예측한 TU값과 측정한 TU값은 Cd와 Zn의 부 피 혼합비가 1:2와 2:1인 경우보다 강한 선형 관계를 보였 다(Fig. 4). 또한 Cd와 Zn의 부피 혼합비가 1:1인 경우와 2:1인 경우 예측 독성 값은 측정 독성 값의 4배 정도 높았 으나, Cd와 Zn의 부피 혼합비가 1:2인 경우 예측 독성 값 은 측정 독성 값의 약 2.4배였다(Fig. 4).

Fig. 4. Relationship between the estimated and the measured toxic effects (in toxic unit) onDaphnia magnaupon exposure to mixtures of cadmium (10 mg L-1) and zinc (100 mg L-1) at mixing ratios (v/v) of (a) 1:1, (b) 1:2, and (c) 2:1.