Microcystis 세포 배양, 동정 및 현미경 계수

2.1.

본 연구에서 사용한 M. aeruginosa는 낙동강의 강정 고 령보 인근인 경북 칠곡군 기산면 행정리에 위치한 제2왜관 교에서 채집된 것이다. 이는 광학현미경(Axio Imager A2; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 100배-1000배 하에서 관 찰되었고, ^{Komárek and Anagnostidis (2008)}을 참고하여 동 정하였다. 파스퇴르 피펫으로 한 개의 군체를 단일 분리하 여 BG-11 배지에 배양 후, M. aeruginosa strain KG07이라 명명하였으며, 대량 배양하여 이후 실험에 사용하였다.

현미경하의 계수는 시료 또는 시료 희석액 1 ml를 Raftsedwick chamber (^{Sournia, 1978})에 넣고, 검경에 의하여 생세포수를 계수하였다.

2.2. Genomic DNA (gDNA)의 추출

배양된 M. aeruginosa strain KG07를 15,000 rpm에서 15분 간 원심분리 한 후 DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany) 를 사용하여 각각 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 spectrophotometer (Eppendorf, Germany)로 농도를 정밀 정량측정 후, -20°C에서 보관하며 연구에 사용하였다.

mcyB 특이 초고속 PCR의 현장 검사를 위한 초 고속 DNA 추출

2.3.

시료를 채취하는 현장에서 바로 mcyB 특이 초고속 PCR 에 의한 정량 실험을 수행하기 위하여, 보다 빠르고 쉬운 유전자 분리방법을 고안하고, 이 방법에 의한 DNA시료가 정량을 위한 유전자시료가 될 수 있을 것인지를 검토하였 다. 적용된 간단한 gDNA의 추출 방법은 99°C에서 끓임과 액체질소를 사용한 얼림의 방법이었으며, 양자 모두 5.0 × 10⁶ 세포/ml로 계수된 KG07의 100 μl를 사용하였다. 100 μl의 세포배양액은 끓임과 얼림을 각기 1분, 2분, 3분, 5분, 10분간 처리한 후, 바로 상온으로 조정하고, 각기 1 μl씩을 분자 수 정량을 위한 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다. 연속 희석에 의하여 세포의 농도를 조정하고 이에 따른 끓 임과 얼림의 처리 효과도 각기 측정되었으며, 현장수를 사 용한 현장 정량 실험에서도 그 유효성을 입증하였다.

mcyB 특이 유전자의 클론화 및 염기서열 결정

2.4.

mcyB 유전자의 정량을 위한 표준기질 DNA를 제작하고 자 유전자 클론화를 수행하였다. 먼저 PCR 반응을 통하여 목적 유전자 mcyB의 일부를 확보하였으며, 이때 PCR의 조 성은 KG07로부터 순수 분리한 44 ng gDNA를 주형으로 10 μM의 특이 프라이머 쌍, 각 2.5 mM dNTP, 10x PCR buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 25 μM MgCl₂, pH 8.3), Taq polymerase (Geneclone, 1 Unit)로 총 20 μl 이었다. PCR에 사용된 프라이머는 Microcystis aeruginosa 의 mcyB 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 TOX2M (5’-CCAATCCCTATCTAAACACAGTAACTCGG-3’), TOX2P (5’-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3’)를 선 정하여 사용하였으며(^{Dittmann et al., 1999}), 이를 초고속 PCR에서도 동일하게 사용하였다(Supplement Fig. 1). PCR 의 온도 및 시간조건은 95°C 초기변성 5분 후, 95°C 변성 30초, 66°C 혼성 30초, 72°C 중합 30초를 30회전 수행하였 다. McyB 유전자의 PCR 증폭산물은 TA cloning하여 확보 하였다. 방법을 약술하면, Xcm I (NEB, England) 제한효소 를 사용하여 절단시킨 pBlueXcm (pBX) vector와 mcyB 특 이 PCR 증폭산물을 ligation한 후, 대장균 DH5αF’에 형질전 환 시킨 것이며, 이를 항생제 함유 배지에서 군락들을 선발 하고, primer TOX2M/TOX2P를 사용한 colony PCR을 통해 대장균 클론을 선별하였다(^{Yoon et al., 2014}). 선별된 클론 들의 재조합 DNA는 양방향 염기서열의 결정 후(Solgent, Korea), pMcyB-355라 명명하였으며, 이 355염기 크기의 염 기서열은 GenBank의 염기서열 분석에서 M. aeruginosa stain B-47 (GenBank, AB474594)의 mcyB 유전자와 가장 유사한 것 으로 분석되었으나, 동일한 서열이 아니었다(identity, 354/355 nts). 따라서, M. aeruginosa KG07에서 유래된 mcyB의 염기 서열(pMcyB-355)은 GenBank에 새로이 등재되었다(GenBank Accession Number: MF576158). 대장균에서 pMcyB-355 DNA는 Fast DNA-spin™ Plasmid DNA Purification kit (iNtRON, Korea)로 분리하였으며, 분리된 DNA는 OD260 (Optical Density 260 nm)으로 정량 한 후, -20°C에서 보관 하며 연구에 사용하였다.

mcyB 특이 유전자 초고속 검출을 위한 PCR 조 건 최적화

2.5.

초고속 PCR의 주형으로 재조합 DNA pMcyB-355를 사 용하였으며, 정량 된 DNA의 분자 수를 계산하여 1.0 × 10⁸ 분자를 기준으로 연속 희석하여 초고속 PCR에 사용하였다. 초고속 PCR은 GENECHECKER (Genesystem, Korea)를 사 용하였으며, PCR 조성은 2× Rapi mix (Genesystem, Korea) 를 사용하여 1 μl templated DNA, 각 1 μl primer를 포함 하여 총 10 μl로 조성하였다. 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 30초 후, 95°C 변성 3초, 혼성 3 초, 72°C 중합 3초를 표준으로 하였고, 총 40회전을 진행 하였다. 최적 혼성 온도는 57-65°C 범위에서 확인하였으며, 최적의 프라이머 농도는 4 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.25 μM에서 각기 측정하여 C_T (Threshold Cycles)값이 가 장 빠르게 측정되는 것을 선정하였다. 이때 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 상기의 표준조건부터 최적 혼성온도 와 시간을 C_T값과 최대 형광값을 기준으로 재조정하였다.

mcyB 특이 유전자의 최소 검출 시간에 따른 검 출 한계 측정

2.6.

mcyB 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시간에서 특이 검 출의 한계를 측정하기 위하여 초고속 PCR의 각 회전 중 변성, 혼성, 중합의 시간을 각각 3초에서 1초까지 감소시켜 각 온도와 시간 조건별 C_T 값과 C_T 값이 측정되는 시간(C_T time)을 측정하였다. 이 측정에는 재조합 DNA pMcyB-355 를 10⁸ 분자부터 10⁰ 분자까지 연속 희석하여, 초고속 PCR 의 주형으로 사용하였으며, 초고속 PCR의 각 단계에서 시 간 및 온도 조건도 가감하여, mcyB 특이 초고속 PCR이 최 소 검출 시간 내에 검출 가능한 최소 한계를 추구하였다.

2.7. 배양된 KG07의 DNA에서 mcyB 특이 초고속 PCR 을 이용한 정량

배양된 KG07을 현미경 하에서 계수하여, 5.0 × 10⁶ 세포 /ml로 조정하였고, 이를 5.0 × 10⁵ 세포/ml, 5.0 × 10⁴ 세포 /ml, 5.0 × 10³ 세포/ml (5.0 세포/μl)가 되도록 1/10씩 연속 희석하였다. 이들 연속 희석된 시료들은 15,000 rpm, 15분 의 원심분리로 침전세포들을 회수하였으며, DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 각기 gDNA의 분리에 사용되었다(최종량은 각기 100 μl).

한편, 배양액(M. aeruginosa strain KG07, 5.0 × 10⁶ 세포/ml) 및 연속 희석된 배양액의 각 100 μl씩을 별도 원심분 리관에 옮기고, 이들을 액체질소로 1분간 동결시킨 후 해 동하여 세포 파쇄액을 각기 제조하였다. 분리된 gDNA 용 액 및 세포 파쇄액의 각 1 μl는 mcyB 특이 초고속 PCR의 주형으로 사용하였으며, 구해진 C_T 값을 기준으로 각각 함 유하고 있는 분자 수를 계산하였다.

정량의 표준은 OD260 정량으로 구한 재조합 DNA pMcyB- 355의 양을 계산에 의하여 1.0 × 10⁸ 분자/μl로 조정한 용액 이었으며, 정량선을 구하기 위하여 이를 연속 1/10 희석한 10⁸ - 10⁰ 분자/μl의 용액들을 제조하였고, 이들을 각기 초기 주형으로 최적화된 mcyB 특이 초고속 PCR에 사용하였다. 표준 mcyB 분자들에 의해 초고속 PCR로 구해진 각 C_T 값 은 회귀식(regression equation) 작성에 사용되었으며, 이를 이용하여 모든 C_T 값은 초기 주형의 분자 수로 계산할 수 있었다.

계수 후 희석된 M. aeruginosa strain KG07의 개체 수는 동일 시료에서 추출된 gDNA와 동결 파쇄한 세포 파쇄액 에서 계산된 초기 주형의 분자 수와 비교 분석되었다.

2.8. 정량된 M. aeruginosa strain KG07을 혼합한 현장 수의 mcyB 특이 초고속 PCR에 의한 정량

배양된 KG07 (6.3 × 10⁶ 세포/ml로 계수)을 경기대학교 내 호수에서 채취한 현장수로 1/10씩 연속 희석 하였으며, 사용된 현장수는 Microcystis가 없음을 확인하였다. 최종 세 포농도는 5.0 × 10⁶ 세포/ml부터 5.0 × 10³ 세포/ml까지 조정 하였다. 현장수로 희석된 각 농도의 KG07들은 1 ml를 정 량 하여 각 gDNA로 분리하였으며, 분리된 gDNA 1 μl를 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다.

2.9. 현장 시료의 gDNA에서 mcyB 특이 초고속 PCR에 의한 정량

녹조현상이 일어난 수역(광교저수지, 수원시)으로부터 채 집한 현장시료(현장수)를 현미경 하에서 계수한 결과, 각각 5.3 × 10² 세포/μl, 4.4 × 10⁴ 세포/μl의 Microcystis species로 계수되었다. 계수된 시료는 각 100 μl씩 액체질소로 1분간 동결시킨 후 해동하여 세포 파쇄액을 제조하였다. 균질화된 세포 파쇄액을 1/10씩 연속 희석하였으며, 각 세포 파쇄액 의 원액 및 희석액 1 μl를 분자 수 정량을 위한 mcyB 특 이 초고속 PCR의 초기 주형으로 사용하였다.

mcyB 특이 초고속 PCR의 조건 최적화

3.1.

mcyB 특이 초고속 PCR에서 최적의 혼성 온도를 파악하 고자, 재조합 DNA 1.0 × 10⁵ 분자 pMcyB-355를 사용하였 으며, 초고속 PCR의 온도 및 시간 조건은 95°C 초기 변성 30초 후, 95°C 변성 3초, 57-65°C 혼성 3초, 72°C 중합 3 초를 표준으로 총 40회전 진행하였다.

가장 빠른 C_T는 혼성 온도 59°C일 때 23.02회전으로 측 정 되었으며, 이에 이르기까지 소요된 PCR 시간(C_T time) 은 9분 21초이었다(Fig. 1).

Fig. 1. Optimization of themcyB-specific Ultra-Rapid PCR using various annealing temperatures. The optimal annealing temperature for the Ultra-Rapid PCR was tested in the range from 57°C to 65°C. At 59°C, the lowest CTof the 23.02 cycles and the fastest CTtime of 9 minutes and 21 seconds were measured, respectively.

초고속 PCR에서 mcyB 특이 프라이머들의 최적 농도를 구하기 위하여 각 4 μM, 2 μM, 1 μM, 0.5 μM, 0.25 μM 의 농도로 실험하였으며, 각 3회 반복하여 결과를 판정하 였다. 특이 프라이머의 최적 농도는 가장 빠른 C_T 값과 최 종 형광 값을 기준으로 판단 하였으며, 최종 농도 4 μM에 서 초고속 PCR은 가장 빠른 21.04회전의 C_T 값을 보였으 나, 최종 형광 값은 비교적 낮게 측정되었으며, 전기영동 결과(자료 미제시)에서도 최종농도 4 μM의 초고속 PCR의 산물들은 상대적으로 약한 증폭량을 보였기에 최적조건에 서 제외하였다.

결국, mcyB 특이 초고속 PCR에서 최적 프라이머의 농도 는 C_T 값(C_T= 21.04 ± 0.55), 최종 형광값(256.67 ± 11.93) 모두에서 우수한 결과를 보인 2 μM을 최적 프라이머 농도 로 결정하였다(Fig. 2).

Fig. 2. Optimization ofmcyB-specific Ultra-Rapid PCR using various concentrations of primers. Using various concentrations of primers, the optimal concentrations ofmcyB-specific primers were selected for the Ultra- Rapid PCR. Using 4 μM primers each, the CTwas estimated as lowest value than others; however, the final fluorescence value was critically low. Based on these reasons, the optimal concentration of primers was selected as being 2 μM (CT= 21.04 ± 0.55 cycles, F = 256.67 ± 11.93).

mcyB 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시간

3.2.

PCR의 회전 중 각 단계의 시간 단축은 초고속 검출에 있어서 전체 검사 시간을 단축하는데 중요한 요인이다. mcyB 유전자의 최단 시간 검출을 위해, PCR 각 단계의 시 간을 3초에서 1초까지 조절하여 초고속 PCR을 시행하였으 며, 이 과정에서 최적 조건을 위하여 변성, 혼성, 중합 온 도를 또한 조정하였다.

1.0 × 10³ mcyB 분자를 기질로 사용한 초고속 PCR에서 각 혼성 시간을 3초로 조정한 결과, C_T값은 29.01회전으로 증가되었으며, C_T time은 8분 1초로 mcyB 특이 유전자의 증폭을 확인 할 수 있었다. 같은 조건에서 각 혼성 시간만 2초, 1초로 감소시킨 초고속 PCR들은 해당 C_T값이 다소 증감하는 결과를 보여주었으나, 해당 C_T time은 1초의 경 우 분명한 감소세를 보여주었다(Fig. 3).

Fig. 3. Minimum time of annealing and polymerization in amcyB-specific Ultra-Rapid PCR. The annealing time and polymerization time were shortened to set the minimum detection time inmcyB-specific Ultra-Rapid PCR. The denaturation step was fixed at 1 second for each cycle of the PCR, and the times of the annealing step and polymerization step were shortened from 3 secs to 1 sec, respectively.

한편, PCR 반응에서 중합 시간 역시 3초에서 2초, 1초로 감소시킨 결과, 1초의 중합 시간을 준 초고속 PCR에서 C_T 값은 31.16회전으로 측정되어 미세하게 증가됨을 보여주었 으나, C_T time은 7분 23초로 크게 감소하는 것으로 측정되 었다. 이는 mcyB 특이 초고속 PCR의 각 변성, 혼성, 중합 시간을 각 1초로 설정하여도 특이 증폭이 가능함을 보여준 것이다(Fig. 3).

그러나, 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1초, 2초, 1초로 단축한 결과, DNA 증폭을 나타내는 형광곡선은 초기 주형 량에 따라 정상적 증가를 보여 주었으나, 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1초, 1초, 1초로 단축한 최단 시간의 열변환 (thermocycling)의 조건은 DNA 증폭을 나타내는 형광곡선 이 크게 왜곡되는 것이 자주 나타나는 현상을 발견하게 되 었고, 이 이유로 mcyB 특이 초고속 PCR은 시스템의 안정 성도 고려하여 각 회전의 변성, 혼성, 중합 시간을 각기 1 초, 3초, 1초로 수행하는 것을 최적화의 조건으로 정하게 되었다(Supplement Fig. 1).

최적조건하에서 mcyB 특이 초고속 PCR의 최소 검출 시 간을 측정한 결과, 초기 주형으로 1.0 × 10⁸ mcyB 분자가 주어진 경우 9.80 회전 만에 C_T 선에 도달하였으며 이 시 간 즉, C_T time은 3분 21초(초기 변성 30초 포함)이었다. 형광의 강도는 25회전(C_T time으로 7분 40초) 전후에 최대 형광값(증폭된 DNA량)을 나타내었으며, 50회전의 초고속 PCR은 16분 35초에 종료되었다.

초기 주형으로 1.0 × 10⁵ mcyB 분자가 주어진 경우 21 회 전 수준에서 C_T 값을 보였으며, C_T time은 6분 수준이었다. 또한, 1.0 × 10² mcyB 분자가 주어진 경우 32회전 수준에서 C_T 값을 보였으며, C_T time은 10분 이내이었다(Supplement Table 1; Fig. 4).

Fig. 4. Detection limit ofmcyB-specific Ultra-Rapid PCR with diluted specific DNAs. The detection limit of themcyB gene was estimated using themcyB-specific Ultra-Rapid PCR under the minimum times of thermocycling (1 sec of denaturation step, 3 secs of annealing, 1 sec of polymerization). 1 × 100 molecules of pMcyB-355 was also amplified. The Tms of all PCR products were measured as being 82.75°C, except for the PCR product using none template (N; Tm = 86.25°C).

mcyB 특이 초고속 PCR의 검출 한계 및 정량 범위

3.3.

최적화된 mcyB 특이 초고속 PCR에서 mcyB 유전자의 초 기 주형양에 대한 검출 최소 한계를 측정하였다. 사용된 초기 주형은 pMcyB-355 재조합 DNA이었으며, 1.0 × 10⁸ 분자를 1/10씩 연속 희석하여 1.0 × 10⁰ 분자까지 각기 사 용하였다. 이 표준시료들은 각기 mcyB 특이 초고속 PCR로 C_T 값을 측정하고 검출 한계 및 표준 정량식을 구하였다 (Fig. 4).

상기의 조건에서 mcyB 유전자는 초기 주형 1.0 × 10⁸ 분자 부터 1.0 × 10⁰ 분자까지 각 C_T 값에 비례하는 정확한 증폭 이 이루어졌으며, 모두 82.75°C로 일치된 Tm (Temperature of midpoint)을 보여주었다.

한편, 초기주형 1.0 × 10⁰ 분자의 경우, mcyB 특이 초고속 PCR에서 나타난 평균 C_T 값은 38.07회전이었고, 평균 C_T time은 11분 36초로 측정되었으나, 초기 주형 1.0 × 10⁰ 분 자는 사실 1개 분자에 해당되는 극단의 희석 때문인지 특 이 증폭 자체가 되지 않는 결과도 자주 발생되었다.

전반적으로 초기 주형 1.0 × 10⁸ 분자부터 1.0 × 10¹ 분자까 지는 각 분자 수와 해당 C_T 값과 매우 정확한 연관관계를 보여주었으며(Regression equation: y = -3.4905x + 38.273 [y = numbers of initial mcyB molecules]; Regression coefficient: R² = 0.9977; Amplification efficiency (E value) = 93.41 %), 이 범위가 mcyB 특이 초고속 PCR에서 정량 가능 범위로 판단하였다(Fig. 5). 상기의 범위에서, 초기분자량을 10 : 1 로 하여 구해진 각 초고속 PCR의 C_T값 간의 차, 즉, dC_T10 은 평균 3.53회전으로 계산되었다.

Fig. 5. Regression equation based on themcyB molecules and CT using mcyB-specific Ultra-Rapid PCR. dCT10indicates a difference between the CTvalues (cycles) of PCR using a 10-fold diluted initial templates.

아울러, mcyB 특이 주형 대신 증류수를 넣어준 mcyB 특 이 초고속 PCR은 46회전 부근에서 C_T선을 넘는 이상증폭 이 관찰되었으나, 그 Tm값은 정상 Tm과 4°C수준의 차이 를 보이는 86.25°C로 측정되어 특이적 증폭이 아님을 쉽게 판단할 수 있었다(N; none template, Fig. 4).

3.4. 배양된 KG07에서 다양한 방법으로 추출된 gDNA 를 이용한 초고속 정량

KG07를 배양한 후, 이를 연속 희석하여, 현미경 하의 계 수와 각 배양희석액으로부터 gDNA를 3가지 방법으로 분 리 또는 추출하여 초고속 정량 PCR에 적용하였다.

먼저, 현미경 하의 계수는 배양액 및 연속 희석한 세포액 1 ml를 Raft-sedwick chamber (^{Sournia, 1978})에 넣고, 생세 포의 검경에 의한 계수로 해당 세포의 농도를 구하였고, 이와 병행하여 크리스탈 바이올렛에 의한 염색 및 포름알 데히드에 의한 고정 후 검경하여 계수하였다. 양자는 약간 의 불일치를 보였으나 생세포의 검경에 의한 계수를 우선 으로 하였다(supplement Table 2).

gDNA의 분리는 100 μl의 배양희석액을 각 DNeasy Plant Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 gDNA를 분리하는 방 법과 99°C에서 각 1분, 2분, 3분, 5분, 10분으로 처리하는 방법, 그리고 액체질소를 사용하여 각 1분, 2분, 3분, 5분, 10분으로 동결시키는 3가지 방법을 사용하였다. 후자 2가 지 방법의 경우, 처치 후 즉시 냉각 또는 해동시키고 그 중 1 μl를 바로 분자 수 정량을 위한 초고속 PCR의 주형 으로 사용하였다.

먼저, 현미경에 의한 계수에서 2.3 × 10³ 세포/μl인 배양액 은, 동량의 분리된 gDNA를 이용한 mcyB 특이 초고속 정 량 PCR에서 1.3 × 10⁴ mcyB 분자/μl로 계산되었으며(C_T = 23.89 ± 0.44), 99°C 처리 후 바로 정량된 것은 6.7 × 10³ mcyB 분자/μl (C_T = 24.93 ± 0.80)로, 액체질소 동결 처리 후 바로 정량된 것은 7.3 × 10⁴ mcyB 분자/μl (C_T = 21.29 ± 0.02) 로 계산되었다(Fig. 6).

Fig. 6. Comparison among the numbers of cells or molecules based on Counting, Isolation of gDNA, Extractions using boiling or using freezing from culturedM. aeruginosastrain KG07. As initial templates formcyB-specific Ultra-Rapid PCR, the isolated gDNA (□), Extractions by boiling (△), or by freezing (○) were used in the same quantities of directly counted cells (2.3 × 104cells/μl) under the microscope, respectively. A black line with a dot (●) was calculated by using a regression based on the quantitatively measuredmcyB-specific DNAs and estimated CTsbymcyBspecific Ultra-Rapid PCR, respectively.

상기의 결과는 현미경의 의한 계수가 3가지 시료의 전처 리 후 얻어진 DNA 주형에 대한 mcyB 특이 유전자의 정량 값보다 상대적으로 낮음을 보여주고 있으며, 고농도의 세포 배양액을 다시 희석하여 현미경하에서 계수해 본 결과, 배 양희석액 중 Microcystis 세포 수는 희석비대로 감소되지 않고 이 과정에서 상당한 오차가 발생할 수 있음이 발견되 었다. 이는 Microcystis와 같은 생물체를 균일하게 희석하는 것은 용해되어 있는 분자를 희석하는 것과 달리 매우 어려 운 것으로 판단하게 되었다.

반복 실험 결과, 액체질소로 동결 처리한 방법은 부유되 는 Microcystis 세포를 원심분리로 모아 gDNA를 분리하는 방법에 비하여 보다 손실이 적었으며, 99°C로 끓이는 방법 보다 안정적이었고, 액체질소에 의한 동결 처리 시간도 1 분 이상이면 거의 균일한 값으로 측정되었다(자료 미제시).

따라서 mcyB 특이 초고속 PCR의 현장실험은 현장 시료 (현장수 100 μl)를 담은 1.5ml 원심분리관을 소량의 액체질 소가 담긴 용기에 넣고 1분간 동결시킨 후, 해동시키고 균 일한 분자 수용액이 되도록 충분히 혼합한 후, 그 중 1/100 (1 μl 정량)를 초고속 PCR의 주형으로 사용하게 되었다.

3.5. 계수된 M. aeruginosa strain KG07을 혼합한 현장 수의 초고속 PCR에 의한 정량

현장시료(현장수)는 M. aeruginosa 외의 다른 생물, 환경 DNA (environmental DNA; eDNA) 그리고 다양한 오염원 이 존재할 수 있을 것으로 가정되어 이런 요인들이 본 연 구에서 제안하는 mcyB 특이 초고속 PCR에 영향을 미칠 수 있는지 실험하였다.

배양된 M. aeruginosa strain KG07 (6.3 × 10⁶ 세포/ml로 계수)을 경기대학교 내 호수에서 채취한 현장수로 1/10씩 연속 희석하였으며, 최종 세포 농도는 5.0 × 10⁶ 세포/ml부 터 5.0 × 10³ 세포/ml까지 조정하였다. 현장수로 희석된 각 농도의 KG07들은 1 ml를 정량하여 각 gDNA로 분리하였 으며, 그 중 1 μl를 초고속 PCR의 주형으로 사용하였다. 따라서 초고속 정량 PCR에 주어진 주형의 양은 5.0 × 10³ 세포/μl부터 5.0 × 10⁰ 세포/μl에서 분리된 것이다.

5.0 × 10³ 세포/μl, 5.0 × 10² 세포/μl, 5.0 × 10¹ 세포/μl에 대 한 mcyB 특이 초고속 PCR들의 C_T 값은 25.90회전, 30.07 회전, 37.08회전으로 측정되었으며, 5.0 × 10⁰ 세포/μl의 경 우는 C_T 값이 측정되지 않았다.

재조합 DNA pMcyB-355를 이용한 회귀식(Regression equation; y = -3.4905x + 38.273, R² = 0.9977)을 이용하여 계 산된 정량 값은 3.5 × 10³ 분자/μl (5.0 × 10³ 세포/μl), 2.2 × 10² 분자/μl (5.0 × 10² 세포/μl), 2.1 × 10⁰ 분자/μl (5.0 × 10¹ 세포/μl)으로 나타났으며, 각기 계수된 세포 수에 비하여 약 1/2로 감소된 분자수로 계산되었다. 이 결과는 계수된 세포 수와 mcyB 특이 초고속 PCR에 의하여 계산된 세포 수와 약간의 차이만 있음을 보여주며, 10¹ 세포/μl 이상에 서 현장수를 사용한 정량이 충분히 가능한 범위에 있음을 보여주었다(Fig. 7).

Fig. 7. Comparisons among the numbers of cells or molecules based on Counting, Isolation of gDNAs from serially dilutedM. aeruginosastrain KG07 with field water. As the initial templates formcyB-specific Ultra-Rapid PCR, isolated gDNAs from 5.0 × 101cells/μl (○), 5.0 × 102cells/μℓ(△), and 5.0 × 103cells/μl (□) ofM. aeruginosastrain KG07 and field water were used, respectively. A black line with a dot (●) was calculated by using a regression based on the quantitatively measuredmcyB-specific DNAs and estimated CTsbymcyB-specific Ultra-Rapid PCR, respectively.

3.6. 현장 시료의 계수와 mcyB 특이 초고속 PCR에 의한 정량

다수의 현장 시료(현장수)를 채취하고, 이를 현미경하에 서 계수하였으며, 동시에 mcyB 초고속 PCR에 의한 정량을 수행하여, 시료 중 M. aeruginosa의 양을 비교하였고, mcyB 특이 유전자의 수에 근거한 정량식을 계수에 의한 정량식 으로 보정하고자 하였다.

먼저, 3개의 현장시료를 현미경 하에서 M. aeruginosa의 농도를 계수한 결과, 6.8 × 10³ 세포/μl (6.8 × 10⁶ 세포/ml), 5.0 × 10⁴ 세포/μl, 2.0ⅹ 10⁵ 세포/μl로 계수되었으며, 이 시 료들은 mcyB 특이 초고속 PCR을 위하여, 각 시료의 100 μl를 정량하여, 1분간 액체질소에 의한 동결을 시행하고, 해동한 후 균질화된 세포파쇄액 1 μl를 초고속 PCR에 사 용하였다. 측정된 C_T 값은 순서대로 30.56, 27.32, 24.00으 로 나타났으며, 이를 mcyB 특이 유전자의 수에 근거한 정 량식(회귀식; y = -3.4905x + 38.273)에 적용하면, 순서대로 1.6 × 10² mcyB 분자/μl, 1.4 × 10³ mcyB 분자/μl, 1.2 × 10⁴ mcyB 분자/μl로 계산되었다.

이 계산된 정량 값은 현미경 하에서 계수한 값에 비하여 97.6% 감소(6.8 × 10³ 세포/μl), 97.2% 감소(5.0 × 10⁴ 세포/μl), 94% 감소(2.0 × 10⁵ 세포/μl)로 계산되었다.

현미경하의 계수 값과 초고속 PCR에 의한 계산 값이 불 일치 하는 이유로, 1) gDNA추출 방법이 불완전한 것인가, 2) 추출된 gDNA의 일부만 초기주형으로 작용하는 것인가, 3) 현장수에 초고속 PCR을 저해하는 요소가 있는 것인가? 4) 현미경 계수에서 과다 또는 과소 계수의 요인이 있는 가? 등이 추론되었으나, 1)과 2)의 이유는, 우선, 배양된 M. aeruginosa strain KG07에 대한 반복적인 추출과 DNA 희 석에 의한 실험결과의 검토에서 가능성이 낮은 것으로 판 단되었다.

현 시점에서 현미경하에서 계수한 값을 기준으로 mcyB 특 이 초고속 PCR의 계산 값을 맞추는 보정이 최선이라 판단되 었으며, 보정하는 방법으로 간단히, 재조합 DNA pMcy355의 결과로 계산된 표준 회귀식(y = -3.4905x + 38.273; Fig. 5)을 상하로 조정하는 것을 고안하게 되었다.

본 실험에서 6.8 × 10³ 세포/μl (6.8 × 10⁶ 세포/ml)로 계수 된 현장수의 초고속 PCR의 C_T값은 30.56회전이었기에, x 축 6.8 × 10³ 분자/μl와 y축 30.56회전이 만나는 지점까지 회귀식을 수직 이동시키는 것을 제안하는 것이며, 이로써 보정된 정량식은 y = -3.4905x + 43.937이 될 것이다. 같은 방법으로 5.0 × 10⁴ 세포/μl 그리고 2.0 × 10⁵ 세포/μl로 계수 된 현장시료들은 각기 측정된 C_T값 27.32회전, 24.00회전을 근거로 정량식을 새로이 보정할 수 있으며, 보정된 정량식 은 각 y = -3.4905x + 43.722 그리고 y = -3.4905x + 42.503이 될 것이다(Fig. 8).

Fig. 8. Calibration of the Regression equation based onmcyB molecules and CTusing specific Ultra-Rapid PCR to directly countedM. aeruginosacells. A regression equation based on the pMcyB355 molecules was y = -3.4905x + 38.273. Using the whole gDNA from directly counted 6.8 × 103cells/μl (○), a CTvalue was estimated at 30.56 cycles bymcyB-specific Ultra-Rapid PCR. Calibration to number by directed counting was achieved by shifting of regression equation on pMcyB355 to this point. Then, the calibrated equation was converted to y = -3.4905x + 43.937.

또한, 별도로 제안하는 보정법은 현장수를 즉시 현미경 계수하고, 같은 현장수에서 동결 추출된 M. aeruginosa의 gDNA 수용액을 원액 및 1/10씩 연속 희석한 gDNA 수용 액들로 만들어 각기 초고속 PCR에 의한 정량을 수행하는 것이다. 이는 추출된 gDNA 용액은 정확한 희석이 가능하 기에 동일 시료의 희석에 의한 다수 시료의 측정에 통하여 정확한 계산을 추구하는 것이다.

이 실험을 위하여 새로이 채집된 현장수는 현미경하에서 M. aeruginosa가 각기 4.4 × 10⁴ 세포/μl, 5.3 × 10² 세포/μl 로 계수되었으며 각 시료는 100 μl씩을 정량하여 1분간 액 체질소에 의한 동결을 시행하고 해동한 후, 균질화된 세포 파쇄액과 각기 1/10씩 연속 희석한 파쇄희석액 각 1 μl를 mcyB 특이 초고속 정량 PCR에 사용하였다(Fig. 9).

Fig. 9. Calibrations using directly counted cells and measured CT values by mcyB-specific Ultra-Rapid PCR. A regression equation based on the pMcyB355 molecules was y = -3.4905x + 38.273. Using the whole gDNAs from those directly counted 4.4 × 104cells/ μl (□) and 5.3 × 102cells/μl (△), CT values were estimated at 17.06 cycles and 24.35 cycles bymcyB-specific Ultra-Rapid PCR, respectively. Calibration to numbers of cells by direct counting was achieved by CTsof Ultra-Rapid PCR using 10-fold diluted gDNAs from each samples. Then, calibrated equations were newly calculated to y = -3.51x + 33.182, y = -3.38x + 32.873, respectively.

각 시료는 원액 및 1/10씩 연속 희석된 세포 파쇄액을 이용한 mcyB 특이 초고속 PCR에서 각기 C_T값이 측정되었 으며, 이 C_T값들도 각기 독립적인 회귀식을 계산할 수 있 었다. 4.4 × 10⁴ 세포/μl로 계수된 시료의 경우, 세포 파쇄액 을 사용한 mcyB 특이 초고속 PCR은 C_T값이 17.06회전으 로 측정되었으며, 이의 1/10희석액을 사용한 C_T값의 측정 을 통하여 회귀식, y = -3.51x + 33.182 (R² = 0.9925)이 계산 되었다. 한편, 5.3 × 10² 세포/μl로 계수된 시료의 경우, 세포 파쇄액을 사용한 mcyB 특이 초고속 PCR은 C_T값이 24.35 회전으로 측정되었으며, 이의 1/10희석액을 사용한 C_T값의 측정을 통하여 회귀식, y = -3.38x + 35.507 (R² = 0.9899)이 계산되었다. 이 회귀식들은 재조합 DNA pMcyB-355를 사 용한 표준 회귀식, y = -3.4905x + 38.273 (R² = 0.9977)과 y- 절편에서는 차이를 보여주나 그 기울기에서는 높은 유사성 을 보이고 있다. 이 현장시료에서 계산된 회귀식들은 각기 동일 사이트의 다수 시료들에 대하여 mcyB 특이 초고속 PCR의 CT값 측정을 통하여 바로 세포 수를 산출해 낼 수 있는 기준이 될 수 있을 것이다.

계수된 M. aeruginosa의 보다 정확한 농도의 측정은 상 기의 방법으로 gDNA 추출에 의한 mcyB 특이 초고속 PCR 을 적용할 수 있으며, 한번의 초고속 PCR에 의한 정량이 적용된다면 다수의 시료에 대하여 한번의 반응으로 많은 수의 시료들을 간단한 동결 추출에 의한 mcyB 특이 초고 속 PCR에 의하여 빠르게 정량 할 수 있을 것이다.

사실, 광학현미경하에서 Microcystis의 계수는 매우 어려운 전문적 훈련을 필요로 하는 작업이며, 그 과정에서 자칫 많 은 오차를 발생하게 한다. 먼저 부유성향이 있는 Microcystis 의 희석을 위한 균질화는 매우 어려운 작업이며, 계수에 많 이 사용하는 Raft-sedwick chamber (^{Sournia, 1978})의 1칸 은 200배 현미경하에게 시야에 들어오지 않으며, 슬라이드 위의 배양액은 두께가 매우 높아 200배 현미경에서 바닥부 터 수면까지 수 차례의 초점조정이 필요할 정도이다. 이런 현미경 시야에서 Microcystis의 동정 및 계수를 정확하게 하는 것은 매우 어려운 기술이며, 10⁷ 세포/ml의 시료의 경 우 1칸당 수천의 세포를 세어야만 하는 상황에서, 계수자 의 능력에 따른 오차는 매우 클 것으로 생각된다.