1. Introduction

하천과 호수에서 녹조를 유발하는 Microcystis는 독소를 생성하는 대표적인 유해남조류이다. 우리나라뿐만 아니라 미국, 호주 등 많은 나라들이 유해남조류 세포수 측정값을 예경보 발령 기준으로 설정하여 관리하고 있다. 그러나 Microcystis는 자연상태에서 수백~수천 세포가 부정형 집락 을 형성하고, 세포가 중첩되어 구형의 입체 형태를 띠어 현미경 하에서는 정확한 세포수 측정이 불가능하다.

Microcystis 집락을 단일세포로 분리하기 위하여 여러 가지 전처리 방법이 제안되고 있지만, 시료상태에 따라 처리 효율 이 달라 표준화된 전처리 방법으로 활용하기에는 제한점을 가지고 있다. 그 중 수산화나트륨(NaOH) 또는 수산화칼륨 (KOH) 등 화학적 처리방법은 단일세포로 분리되어도 중소형 집락이 잔존하며, 처리농도 높거나 처리시간이 길어질수록 세포 손실도 큰 것으로 보고되고 있다(^{Box, 1981}; ^{Idroos et al., 2013}; ^{Reynolds and Jaworskii, 1978}). ^{Joung et al. (2006)} 은 여러 가지 전처리법을 비교하여 그 중 가열처리법을 가장 효과적인 방법으로 제안하였으나 루골용액에 고정된 집락은 90분 이상 가열처리하여도 해체되지 않은 집락이 잔존하여 시료상태에 따라 가열처리법의 집락해체 효율이 상이할 수 있음을 시사하였다(^{Bernard et al., 2004}; ^{Box, 1981}).

물리적인 방법으로는 교반을 가하여 집락을 깨트리는 교 반(Vortex) 처리 방법과 초음파 처리법 등이 제안되었고, 그 중 교반처리방법은 5분 이상 처리 후에도 중첩된 집락 이 잔존하여 효율성이 떨어지는 것으로 밝혀졌다(^{Joung et al., 2006}). 초음파 처리법은 1 ~ 2분 이내에 집락이 해체되 어, 적정시간 이내 초음파 처리를 하였을 때 짧은 시간에 집락이 분리되며, 세포내 가스포군이 제거되어 현미경 하에 서 세포수 분석이 용이한 것으로 알려져 있다(^{Humphries and Wiljaja, 1979}; ^{Meriluoto et al., 2017}; ^{Rajasekhar et al., 2012}; ^{Reynolds and Jaworski, 1978}; ^{Yamamoto and Nakahara, 2009}; ^{Yamamoto and Shiah, 2015}). 그러나 세포 성장 단계에 따라 오래된 세포일수록 초음파로 인한 세포 손상이 쉽게 나타날 수 있어(^{Cronberg, 1982}; ^{Reynolds and Jaworski, 1978}), ^{Yamamoto and Shiah (2015)}는 세포 손상 을 줄이기 위한 방법으로 루골 용액(Lugol’s iodine solution) 으로 고정 후, 초음파 처리 하는 방법을 제시하였다.

그 외에도 현미경 프로그램(Zen software, 2011)을 이용 하여 집락의 길이와 면적을 측정하여 세포수를 산정하는 간접 측정방법이 있으나, 동일한 크기의 집락이라도 점액질 내 세포 밀집 정도와 세포 크기에 따라 집락 면적에 따른 세포수와 상관성이 낮아 정확한 세포수 산정에 어려움이 있는 것으로 보고되고 있다(^{You et al., 2014}).

우리나라에서 시행하는 조류경보제와 수질예보제는 먹는 물과 친수용 원수에서 발생하는 유해남조류를 모니터링 하여 수질을 관리하는 제도이다. 수질(조류) 관리를 위한 각 발령단계는 유해남조류 4개 속(Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon, Oscillatoria) 세포수 측정값을 기준으로 나 뉘어져 있으며, 조류 분석기관에서 정확하게 분석한 측정값 은 수질 관리기관에 신속하게 제공되어 예경보를 발령에 활용되고, 대국민에게 제공된다. 따라서 다량의 현장시료에 존재하는 Microcystis 세포수를 신속하고 정확하게 측정하 기 위하여 초음파 처리법을 이용하여 집락을 해체하고 단 일세포로 분리하는 방법이 가장 적합할 것으로 판단된다. 그러나 Microcystis 집락은 초음파 세기나 처리시간 등 초 음파에 노출되는 조건에 따라 덜 흩어지거나, 세포가 손상 되어 실제 농도보다 과소평가될 수 있어 정확한 Microcystis 세포수 측정값을 얻는데 한계가 있다.

따라서 본 연구에서는 Microcystis 집락이 단일세포로 분 리되는 초음파 처리 최적 조건을 설정하기 위하여 자연상 태에서 집락을 형성하는 Microcystis 스컴 시료를 이용하여 초음파 처리 조건에 따른 세포수와 집락수 변화, 세포 형 태 변화를 조사하였다. 본 연구결과를 통해 도출된 집락형 Microcystis 초음파 최적 처리 조건은 신속하고 정확한 Microcystis 세포수를 측정을 위한 표준화된 초음파처리 방 법으로 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

2. Materials and Methods

본 연구는 2017년 9월 6일부터 10월 26일까지 낙동강 본 류 창녕함안보 상류 12 km 지점(N35°22'57.6" E128°27'21.4") 에서 채취한 자연상태의 집락형 유해남조류, Microcystis 시 료와 현장수를 이용하여 초음파 조건별 실험을 실시하였다. 실험에 이용된 현장시료는 모두 초음파 처리 실험 직전에 채취하였으며, 현장에서 채취된 스컴 시료는 아이스박스에 보관하여 즉시 실험실로 옮긴 후, 메스실린더에 분주하여 규 조류 등 일반 조류는 침강시키고 상층에 부유된 Microcystis 집락을 분취하였다.

실험 조건에 맞는 시료를 확보하기 위하여 분취된 집락형 Microcystis 스컴 시료를 현장 여과수로 희석하고 시료 조 건을 두 단계로 설정하여 실험에 이용하였다. 저농도 시료 는 Microcystis 세포수가 약 8,000 ~ 25,000 cells/mL, 고농도 시료는 약 40,000 ~ 80,000 cells/mL 내외로 되도록 조제하 였다.

초음파 처리를 위해 초음파처리기(Sonics Vibra cell, Sonics & Materials Inc., VCX 750, USA)를 사용하여 진폭 파장과 진폭세기는 20 kHz, 150 W 조건으로 설정하였으 며, 초음파 처리 시간은 0초(무처리), 20초, 40초, 60초, 80 초, 100초, 150초, 200초, 400초, 600초의 10개 조건으로 설정하였다. 각 조건별로 2회 반복 처리가 되도록 고농도와 저농도의 시료 30 mL을 플라스틱 원심관(conical centrifuge tube)에 분주하였으며, 분주된 시료 30 mL 당 루골 용액을 100 μL를 넣고(^{APHA, 2005}) 15분간 정치 후 처리시간 조 건별로 초음파 처리를 실시하였다. 또한 초음파 처리에 따 른 세포손상을 일으키지 않는 범위 내에서 세포수 측정값을 최대로 얻을 수 있는 최적 처리시간을 도출하기 위하여, 초 음파 처리 90초~ 130초 범위 내에서 10초 간격으로 처리시 간을 정밀하게 설정하여 추가 실험을 실시하였다. 대조군으 로서 0초(무처리) 시료를 루골 고정 후, 초음파 처리 없이 암조건에서 보관하면서 초기 10일간은 24시간 간격, 그 이 후는 7일~ 10일 간격으로 세포수와 집락수를 측정하였다.

초음파 처리 방법에 따른 Microcystis 세포수 변화를 알 아보기 위하여, 초음파를 연속처리(Continuous), 150 rpm으 로 교반을 가하면서 초음파를 연속처리 한 연속교반처리 (Continuous + Stirring), 10초간 초음파 처리 후 10초간 멈 춤을 반복한 펄스처리(Pulse), 150 rpm으로 교반을 가하면 서 10초 간격으로 초음파를 처리한 펄스교반처리(Pulse + Stirring) 등 4가지 처리방법으로 구분하고, 각 처리방법별 로 초음파 처리시간 100초와 110초 조건에서 세포수 변화 를 관찰하였다. 처리방법별 세포수 측정값의 통계적 유의성 검정은 one-way analysis of variance (ANOVA) 분석을 통 해 확인하였다.

각각의 조건으로 초음파 처리한 시료는 1 mL을 Sedgwick- Rafter Chamber에 취하고, 20분 이상 침강시킨 다음, 현미 경(Imager M1, Carl Zeiss, Germany)으로 100배~ 400배율 로 검경하면서 집락수와 세포수를 측정하였다. 세포수는 집 락을 형성하지 않고 단독으로 존재하며, 손상되지 않은 세 포만을 계수하였다. 세포수 계수는 수질오염공정시험기준 (^{ME, 2015})에 준하여 계수면적당 10 ~ 40세포수가 되도록 하여 무작위로 10회 반복하였다. 초음파 무처리 조건(0초) 시료는 종 동정을 위해 집락과 세포형태를 관찰하면서 사 진을 촬영하였다.

3. Results and Discussion

3.1. 낙동강 스컴 시료 중 Microcystis 집락의 종 구성

초음파 무처리 조건(0초) 시료의 Microcystis 집락을 ^{Komárek & Anagnostidis (1998)}의 분류기준으로 동정한 결과, Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa), M. wesenbergii, M. novacekii, M. viridis, M. flos-aquae 등 5개 종이 확인 되었다(Fig. 1).

Fig. 1. Microphotographs ofMicrocystiscolonies from Nakdong River. (a)M. aeruginosa, (b)M. wesenbergii, (c)M. novacekii, (d)M. viridis, (e)M. flos-aquae.

3.2. 초음파 처리시간에 따른 집락형 Microcystis 세포 수 변화

초음파 처리시간에 따른 Microcystis 세포수 변화는 고농도 조건과 저농도 조건에서 모두 100초간 초음파 처리한 실험구 에서 최대 세포수를 보였고(저농도 조건: 19,590 cells/mL, 고 농도 조건: 83,967 cells/mL), 150초간 처리한 실험구부터 세 포수가 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 2(a)). Microcystis 집락의 경우, 대조군에서는 직경 50 μm 미만의 소형부터 직경 1 mm 이상 대형 크기의 집락이 단위부피(1 mL)당 평균 6개(저농도 조건 시료) ~ 41개(고농도 조건시료)가 관 찰되었다. 처리시간에 따른 집락수는 20초간 초음파 처리 한 시료에서 최대값을 나타내었는데, 이는 초음파를 처리하 기 전, 대형의 집락이 중·소형 집락과 단일세포로 분리되 면서 집락수가 일시적으로 증가했기 때문으로 추정되며, 이 후 초음파 처리시간이 길어질수록 집락수는 감소하였다. 저 농도 조건에서는 150초 이상 초음파 처리한 실험구에서 집 락이 거의 잔존하지 않았으며, 고농도 조건은 600초 이상 초음파 처리한 실험구에서 집락이 모두 분리 되는 것으로 나타났다(Fig. 2(b)).

Fig. 2. Variation ofMicrocystiscell densities (a) and colony numbers (b) by ultrasonic treatment time.

초음파 처리에 따른 세포 손상 없이 최대 세포수를 얻을 수 있는 최적 처리시간을 알아보기 위하여 초음파 처리시 간을 90초~ 130초 범위에서 10초 간격 설정하여 처리한 결과, 저농도 조건의 경우, 1차 실험 결과는 110초에서 최 대 세포수(17,907 cells/mL)를 보였으나 100초간 처리한 실 험구 측정값(17,380 cells/mL)과 3 % 이내로 큰 차이가 없 었으며, 2차~ 4차 실험에서는 모두 100초간 초음파 처리를 실시 한 조건에서 최대 세포수를 나타내었다(Fig. 3(a)). 고 농도 조건에서는 초음파 처리를 100초간 실시한 실험구에 서 세포수가 최대밀도를 나타내었고, 110초 이상 처리한 실험구부터 세포수가 감소하는 경향을 나타났다(Fig. 3(b)). 선행 연구결과에서도 초음파 처리시간이 지속될수록 세포 수가 감소되는 것으로 나타났다. ^{Humphries and Widjaja (1979)}는 배양된 M. aeruginosa를 이용하여 20 kHz, 1분간 초음파를 처리하였을 때 세포손상으로 인한 측정값의 오차 가 발생하며, 이와 유사한 결과들이 ^{Box (1981)}의 결과에 서도 제시되었다. 그러나 세포 손상이 측정값에 영향을 미 치기 시작하는 초음파 처리시간은 본 연구결과와 차이를 보였다.이는 선행 연구에서는 대부분 배양된 Microcystis를 대상으로 하였으며, 루골용액에 보존하기 전에 초음파 처리 를 하여 세포 손상이 크게 나타났기 때문으로 추정된다. ^{Yamamoto and Shiah (2015)}의 연구결과에 따르면 루골용 액에 고정된 Microcystis 세포는 초음파에 노출되었을 때 세 포손상이 거의 나타나지 않는 것으로 보고되고 있다. 따라 서 초음파 처리 전 루골용액 보존처리 여부가 초음파 처리 시간에 따른 세포 손상에 영향을 미치는 것으로 판단된다. 따라서 본 연구에서 ^{Humphries and Widjaja (1979)}와 ^{Box (1981)}가 제시한 초음파 적정 처리시간(1분) 보다 40초 더 지속한 100초 처리조건에서 세포밀도가 최대농도를 보인 것 은 초음파 처리 전 루골용액에 일정시간 이상 보존함으로써 초음파 처리에 따른 세포손상이 적었기 때문으로 판단된다.

Fig. 3.

Microcystis cell densities during optimal ultrasonic treatment.

루골 고정 후 초음파 처리 없이 보존한 대조군의 집락수 와 세포수 변화를 보면, 저농도 조건에서는 보존 8일차까 지 세포수가 지속적으로 증가하였고, 26일차에 최대밀도를 보여(19,060 cells/mL) 초음파 처리를 100초 동안 연속처리 한 실험구의 세포수(19,590 cells/mL)와 유사한 범위를 나 타내었다. 고농도 조건에서 초음파를 처리하지 않은 대조군 은 35일차에 세포수가 최대밀도를 보여(92,000 cells/mL), 초음파 처리를 100초간 실시한 조건(83,967 cells/mL)과 약 10% 정도 차이를 보였다. 이는 세포 밀도가 높은 고농도 시료의 경우, 저농도 조건에 비해 단위면적당 초음파에 노 출되는 세포수가 많아 세포 손상 빈도가 높기 때문으로 추 정된다(Fig. 4(a)).

Fig. 4. Variation ofMicrocystiscell densities and colony numbers by Lugol’s solution preservation without ultrasonic treatment.

집락수의 경우, 저농도와 고농도 조건에서 3일차까지는 증 가하였고, 4일차부터 감소하는 경향을 보였는데, 이는 중대 형 집락들이 루골 고정 후 단일 세포와 여러 개의 소형 집 락들로 분리되어 집락수가 증가한 것으로 보인다(Fig. 4(b)). 이러한 결과는 ^{Box (1981)} 연구결과에서도 확인할 수 있었 으며, 자연상태에서 채취한 시료와 배양된 Microcystis 집락 을 대상으로 루골용액을 시료량의 약 1 %가 되도록 처리 하였을 때, 처리 후 3~5일 후부터 Microcystis 집락이 단일 세포로 분리되기 시작하는 것으로 보고되고 있다. 본 연구 에도 루골 고정 후, 초기 3일간은 대형집락이 흩어지면서 소형집락으로 해체되어 집락수가 증가하였고, 이후 단일세 포로 흩어지면서 단일세포수는 증가하고, 집락수는 감소하 는 결과를 나타내어 선행연구와 유사한 경향을 보였다.

3.3. 초음파 처리 방법에 따른 집락형 Microcystis 세 포수 변화

연속, 교반, 펄스, 교반펄스 처리 등 초음파 처리방법에 따 른 세포수 변화를 Fig. 5에 나타내었다. 위의 4가지 처리 방 법별로 100초간 초음파 처리한 실험구의 측정값을 ANOVA 분석 결과, 저농도와 고농도 시료 모두 처리 방법별로 유 의한 차이를 보이지는 않았지만(p > 0.005), 저농도 시료 의 경우, 연속처리구와 연속교반 처리구에서 각각 16,885 cells/mL과 16,890 cells/mL로 세포밀도가 높았다(Fig. 5(a)). 고농도 시료는 연속 처리구에서 세포수가(65,833 cells/mL) 최대밀도를 보였고, 펄스교반 처리구는 연속처리구에 비해 세포수가 약 8% 감소하여 집락이 덜 흩어졌거나, 세포 손 상이 나타났을 것으로 추정된다(Fig. 5(b)). 110초 동안 초 음파 처리한 실험구에서도 각 처리 조건별 측정값은 유의 한 차이를 보이지는 않았지만(p > 0.005), 저농도와 고농도 시료 모두 연속처리한 조건에서 세포수가 최대밀도를 나타 내어, 초음파를 교반 또는 펄스 조건 없이 연속처리할 경 우, 효율이 가장 높은 것으로 판단된다.

Fig. 5. Comparison ofMicrocystiscell densities by four different ultrasonic treatment methods. (a) Low density, (b) High density.

3.4. 초음파 처리 전후 집락 형태 및 세포 형태 변화

초음파 처리 전후 집락의 변화를 현미경으로 관찰한 결 과, 초음파 처리 전의 부정형, 대형 집락들이 초음파 처리 후에 대부분 해체되어 단일 세포로 분리되었으며, 일부 부 정형의 소형 집락이 잔존하였다(Fig. 6). Microcystis 집락 뿐만 아니라 세포의 형태도 초음파 처리에 따라 변화를 보 였다. 초음파 처리 전에는 현미경 하에서 세포내 가스포군 이 관찰되어 세포 표면이 거칠게 보였으나(Fig. 7(a), (b)), 초음파 처리 후에는 가스포군이 제거되어 단일세포 표면이 다소 매끈한 형태로 관찰되었다(Fig. 7(c), (d)). ^{Tsujimura (2003)}의 연구에서도 집락을 형성하는 M. wesenbergii의 경 우, 광학현미경 하에서 세포내 불규칙적으로 존재하는 가스 포군이 관찰되었으나, 초음파 처리 후에 집락은 해체되고, 세포내 가스포군이 제거되어 세포상태가 뚜렷하게 구분 되 었다고 보고되었다. 따라서 본 연구에서도 확인된 바와 같 이 세포손상을 일으키지 않은 범위 내에서 초음파 처리를 할 경우, 세포 내 가스포군이 제거되어 현미경을 이용한 세포수 측정이 용이할 것으로 판단된다. 한편 110초 이상 초음파 처리를 한 경우, 세포가 찌그러지거나 부분적으로 파괴되는 손상이 일어나는 것을 확인 할 수 있었다.

Fig. 6. Microphotograph of intactMicrocystiscolonies (a, b), disintegrated cells (c) and small colonies after ultrasonic treatment (d).

Fig. 7. Microphotograph of single cells ofMicrocystiswithout (a, b) and with ultrasonic treatment (c-h); a: Bright field, b: Phase contrast field, c: Intact cells (bright field), d: Intact cells (phase contrast field), e-f: Damaged cells (bright field), g-h: Damaged cells (phase contrast field).

4. Conclusion

본 연구에서는 자연상태에서 집락을 형성하는 Microcystis 스컴 시료를 이용하여 초음파 처리 조건에 따른 세포수와 집락수 변화, 세포형태 변화 등을 분석하였고, 다음과 같은 집락형 Microcystis 초음파 최적 처리 조건을 도출하였다.