2.2.1. 적조 원인생물의 형태학적 동정 및 계수

적조 원인생물의 동정 및 계수를 위하여 현장에서 채수 한 시료 2 L 중 1 L를 별도의 용기에 옮겨 Lugol 용액으로 고정한 후, 실험실로 운반하였다. 시료 내 세포수에 따라 희석 혹은 원수 그대로 48시간 이상 자연 침강의 방식으로 농축하여 세포의 수가 검경을 통해 개수에 적절한 농도(10 ~ 40 cells/현미경 시야)가 되도록 조절한 후, 시료 1 mL를 취하여 Sedgwick-Rafter chamber에 골고루 분산시킨 다음, 현미경(CARL ZEISS, DE/Axio Imager)을 이용하여 200배 에서 1,600배의 배율로 검경하여 형태적 관찰 및 계수의 결과를 도출하였다. 이 때, 관찰된 식물플랑크톤의 형태학 적 동정은 담수조류도감 등을 참고하였다(^{Graham et al., 2010}; ^{Jeong, 2006}; ^{Wehr and Sheath, 2003}).

2.2.2. 적조 원인생물의 분자생물학적 동정

본 연구기간 중 현미경 관찰을 통해 관찰된 우점종은 형 태적으로 동일한 종으로 판단되었으며, 분자생물학적 동정 을 위하여 2016년 3월과 4월에 채수한 시료 4개를 농축한 바이오매스(약 500 mg)로부터 DNA추출 kit(FastDNA SPIN Kit for soil, MP bio)를 이용하여 genomic DNA를 각각 추 출하고 이들을 혼합하였다.

추출 혼합된 genomic DNA는 적조 원인생물체의 계통 학적 분류 동정을 위하여, 형태학적으로 이미 추정된 cryptomonads계 조류의 분리동정을 더 명확하게 할 수 있 도록 선별된 유전자 부위를 증폭하기 위한 중합효소연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에서 주형으로 사용되 었다. 이 때 선별된 부위는 28S rRNA 유전자 부위(LSU, large subunit), ITS2 (internal transcribed spacer 2) 영역 그리 고 엽록체의 광합성 중심단백질 psbA 유전자 부위이다. 상 기의 부위에 특이적으로 결합하고 증폭시킬 수 있는 primers 를 사용하였으며, 사용한 primer-set의 정보는 Table 1에 나 타내었다(^{Choi et al., 2013}).

PCR반응에서 증폭된 DNA는 정제된 후, T-blunt PCR cloning kit(BIOFACT, Korea)를 사용하여 각 유전자별 clone library를 구축하였다. 각각의 유전자 clones 중 20개 이상의 clones이 임의로 선정되었고, T-blunt 벡터에 삽입된 DNA부위 는 염기서열분석을 의뢰(마크로젠, www.macrogen.co.kr)하여 유 전자 염기서열을 얻어 그 결과를 분석하였다. 이 때, blast search를 통해 chimera를 형성한 PCR산물은 제거되었으며, 나 머지 결과로 얻어진 유전자들의 염기서열은 Mothur program을 통 해 clustering(염기서열 상동성 99 %)을 하여 OTU(operational taxonomic unit)를 얻었다. OTU의 염기서열을 이용하여 NCBI 에서 blast search를 통해 가장 근연도가 높은 염기서열을 찾고, 이들의 염기서열과 OTU의 염기서열을 함께 Clustal W를 통해 align을 한 후, Mega 7 프로그램을 이용하여 계 통도를 작성하였다. 이 때, 분석에 사용한 OTU의 염기서열 은 GenBank에 accession number로서 LC259099와 LC259100 으로 보관되었다.

2.2.3. 수질분석

2015년과 2016년 겨울시기에 일주간 단위로 총 28회 채수 된 물은 아래 각 수질 항목에 대하여 수질오염공정시험기준 에 따라 수질분석에 사용하였다. 수온, pH, 용존산소량(dissolved oxygen, DO), 전기전도도(electronical conductivity, EC), 염분 (salinity)의 농도는 현장측정기(YSI-556MPS, USA)를 이용하 여 현장에서 채수 즉시 측정하였다. 그리고 생물학적 산소요 구량(biological oxygen demand, BOD), 화학적 산소요구량 (chemical oxygen demand, COD) 및 총부유물질량(suspended solid, SS)은 수질오염공정시험기준에 의해 분석하였으며, 총유기탄소(total oxygen carbon, TOC)는 TOC 분석기(TOC-L CPH, Shimadzu, Japan), 총질소(total nitrogen, T-N)와 총인 (total phosphorus, T-P)는 총인총질소분석기(JP/AACS, Germany/Bltec), 그리고 chl-a는 분광광도기(UV/spectrometry, Cary100, USA/Varian)를 이용하여 각각의 농도를 측정하였다.

2.2.4. 부영양상태 평가

채수지점의 부영양 정도를 평가하기 위하여 COD, T-P, chl-a의 수질 결과를 이용하여 한국형 호소부영양화평가지 수(TSIko)를 산출하였다(^{Ahn et al., 2013}).

2.2.5. 통계분석

이상의 모든 수질분석 결과의 통계처리와 crytomonads 세포수와 물리·화학적 환경요인간의 상관성은 SPSS(ver. 10.0 for Eindow)를 사용하여 분석하였다.

2.2.6. Chl-a 농도, 강우 및 조석과의 관계

적조발생에 대한 강우 및 조위의 영향을 파악하고자, 부 산광역시 보건환경연구원에서 채수지점 St 1의 위치에 설치하 여 운영 중인 chl-a 실시간자동모니터링 결과자료(^{Busan Metropolitan City Institute of Health and Environment, 2016}) 와 St 1지점의 동일시기의 강우자료 및 조석자료와 함께 비 교분석하였다. 이 때 사용한 조사기간 내 강수량의 자료 는 기상청 홈페이지(^{Korea Meteorological Administration, 2016})로부터, 그리고 조위자료는 국립해양조사원 제공(^{Korea Hydrographic and Oceanographic Agency, 2016})자료로부터 얻어졌다.

3.1.1. 적조 원인생물의 개체수 및 형태학적 동정

온천천의 적조는 주로 12월 중순에 시작되어 1월에서 3월 사이에 최대 개체수를 보이다가 4월 이후에는 적조생물 개 체수가 줄어들면서 서서히 소멸하는 주기를 가지고 있었다.

본 연구가 진행된 2015년 초에서 2016년 초의 2년에 걸 친 동절기에 발생한 온천천 적조의 주요 원인종은 세포의 크기와 형태로 볼 때, 세포의 길이와 폭이 각각 9 ~ 25 μm, 5 ~ 15 μm의 세포크기를 가지면서 약간 다른 길이의 1쌍의 편모에 의해 매우 활발히 움직이는 은편모조류(cyptomonads, 갈색편모조강)에 속하는 생물종으로 분류되었는데(Fig. 2), 그 중에서도 개체수의 95 % 이상을 차지하는 우점종은 Rhodomonas sp. 또는 Teleaulax sp.로 추정되는 상대적으 로 크기가 작은 집단(길이 9 ~ 15 μm, 폭 5 ~ 9 μm)이었으며, 다소 크기가 큰 cyptomonads(길이 20 ~ 25 μm, 폭 9 ~ 15 μm) 들도 5 % 내외 수준으로 관찰되었다. 그 외 적조를 유발시키는 Mesodinium, Eutreptia, Trachelomonas 속에 해당하는 생물종도 극히 소수로 관찰되었다.

Fig. 2. The organisms shown as the images were observed on different sampling date of Mar. 25 in 2015 (a), Dec. 15 in 2015 (b) and Mar. 3 in 2016. The length of the bar in the images is 10 μm.

3.1.2. 적조 원인생물의 분자생물학적 동정결과

조류의 계통분류에 이용되는 유전자들을 증폭하여 얻어 진 염기서열의 결과를 토대로 적조생물종의 계통분석을 실 시한 결과는 아래와 같다.

우선, ITS2유전자 clones들로부터 얻은 유전자 염기서열 을 기존에 등록된 유전자 pool과의 blast search한 결과에 의 하면, 자낭균류에 속하는 곰팡이류 1종과는 높은 coverage와 유사성을 보여주는 것이 있었으나, 조류의 염기서열과는 유 의한 결과를 보여주지 않았다.

한편, 리보솜의 28S rRNA 유전자 부위(LSU 부분유전자) 를 가진 clones의 경우에는 chirmera를 형성한 clones을 제외 하고는 총 9개의 clones을 얻어졌으며, psbA유전자의 PCR산 물로부터는 총 16개의 유효 clones을 얻을 수 있었다. 이들 두 유전자군으로부터 얻은 유효 clone들은 99 %의 염기서열 homology를 cut-off범위로 clustering하였을 때, 각각의 유전 자에서 1개의 OTU(A13과 C1으로 Fig. 3에 표기됨)로 묶여 졌다. 이는 유전자 증폭산물이 우점한 동일종 유래임을 의미 하며 이들 OTU의 염기서열을 Mega 7 프로그램을 이용하여 계통도를 작성한 결과를 Fig. 3에 나타내었다.

Fig. 3. Phylogenetic trees were constructed using partial 28S rRNA gene (a) and chloroplast gene (b) sequences, employing the neighbor-joining method. The bar indicates a Jukes-Cantor distance of 0.05 (a) and 0.02 (b).

우선 LSU유전자(OTU A13)의 염기서열을 NCBI의 Blast search를 통해 alignment를 한 경우에는 기존 database와 상 동성이 95 % 이상 되는 염기서열로는 분류가 정확하게 되 지 않는 crytophyta의 일종인 것으로 분류가 되었다(Fig. 3a). 반면에 psbA 유전자의 경우에는 본 연구의 OTU C1의 염기 서열이 Teleaulax amphioxeia의 psbA와 98 %의 염기서열 상동성(100 % 염기서열 coverage)을 보여주었다. 이들 결과 는 국내에서 출현한 바가 있는 형태적으로 상호 유사한 Cryptomonas (^{Choi et al., 2013}; ^{Sohn et al., 2013})를 비롯 한 Cryptophyta에 속하는 속들의 psbA 유전자들과 재 alignment에 이용되었으며, 그 결과를 Fig. 3(b)의 계통도에 제시하였다.

분자생물학적 분석 결과에 의하면, 기존의 염기서열 정보 와 비교 시 온천천 유래의 생물종은 Fig. 3(a)의 결과를 통해서 는 Cryptophyta아문에 속하면서 Rhodomonas속과 근연종임을 알 수 있었고, Fig. 3(b)에 의해서는 동일한 Pyrenomonadales 목에 속하면서 Rhodomonas속과는 다른 분류군의 Teleaulax속 에 해당하는 생물종으로 분류되어, 본 연구에서는 2015년 과 2016년도 온천천 적조 원인조류를 Teleaulax sp. OC1으 로 명명하였다.

연구기간 중 수온은 St 1지점이 2.9 ~ 12.8 °C, St 2지점은 7.3 ~ 16.7 °C의 범위로 측정되었으며, 17 °C 이상이 되는 봄 철에는 적조가 점차 소멸되는 점으로 보아 저온에 잘 적응 하는 종에 의해 발생한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 사 실은 본 연구에서 우점종으로 동정되었던 Teleaulax속이 15 °C를 최적배양온도를 가지며 15 °C 이상에서는 온도가 상 승할수록 생물량이 감소한다는 Ministry of Agriculture, Food and Rural Affair (^{MAFRA, 2012})의 연구내용과 잘 일치하는 결과이다. 또한 현미경 검경결과, 형태상으로 Teleaulax속인지 Rhodomonas속의 종인지 구별이 어려웠는데, 상기의 분자생물 학적인 결과뿐만 아니라 Rhodomonas sp.는 20 °C 이상에서 도 더욱 잘 자란다는 보고(^{Baek and Joo, 2012})가 있어 온 천천 적조원인생물이 생태환경적 특성으로도 Teleaulax속임을 확인할 수 있었다.

아울러 본 연구결과를 통해서 살펴본다면 cryptophyta아 문의 적조생물종의 분자생물학적 분류에 있어 보다 더 구 체적인 정보를 제공해 주는 유전자군으로는, ITS2유전자 암호부위나 LSU 유전자 암호 부위보다는 psbA 유전자 부 위가 더 유용한 것으로 나타났다.