2.1. 조사지점 및 기간

조사지점은 북한강수계 중·상류에 위치하는 청평호를 시 작으로 팔당댐 앞까지 조사범위로 선정하였다(Fig 1). 출현 경향 조사는 청평호(CP), 삼봉(SB), 팔당호(P2)를 대상으로 하였고 2012년 3월부터 2014년 12월까지 시료 채취 및 수 온을 측정하였다. 16S rRNA genotype 확인은 청평호(CP), 서종(SJ), 송촌하수처리장(SC), 조안(P4), 팔당호(P2) 지점을 대상으로 하였고, 2015년 7월에 시료를 채취하였다.

Fig. 1. Map showing the sampling sites in Bukhan river.

Dolichospermum sp. 세포수 및 환경요인 분석

2.2.

시료는 표층수를 채취하여 4 °C의 암조건에서 실험실로 운 반하였고, Dolichospermum의 세포수를 측정하기 위하여 루골 용액으로 고정하였다(최종농도 1%, v/v). 고정된 시료는 식 물플랑크톤의 농도에 따라 농축 또는 희석하였고, Sedgwick-Rafter counting chamber를 이용하여 위상차 현미경(Nikon eclipse 80i)으로 100배에서 1,000배로 사이로 동정 및 계수 하였다. 수온은 YSI 6600 meter로 표층에서 측정하였고, 2012년에서 2014년의 강우량은 기상청(http://www.weather.go.kr) 자료를 이용하였다.

Dolichospermum sp. 단일 세포 분리 및 PCR

2.3.

Dolichospermum의 단일 세포는 채취된 표층수에서 Capillary 피펫으로 형태(직선형, 나선형)에 따라 분리하였다. 분리한 Dolichospermum의 DNA 추출은 DNA Mini Spin kit (Qiagen, Valencia, CA)의 protocol을 따랐다. 추출된 시료에서 16S rDNA를 증폭하기 위한 primer로 CYA106F (CGG/ACG/GGT/GAG/TAA/CGC/GTG/A)/CYA781R(GAC/TAC/T(A)GG/GGT/ATC/TAA/TCC/CA(T)T/T)를 이용하였다(^{Nübel et al., 1997}). PCR은 solg™ 2X Taq smart mix 2 (Solgent, Korea) 을 사용하였으며 제조 방법에 따라 2X Taq PCR smart mix 2 12.5 μL, primer 0.2μM, 주형 DNA 2.5 μL에 멸균된 증 류수를 첨가하여 최종 25 μL로 제조하였다. PCR 반응 조 건은 95 °C에서 5분간 초기 denaturation을 준 후, 95 °C (denaturation)에서 20초, 59 °C (annealing)에서 1분, 72 °C (elongation)에서 1분을 35회 반복하였으며, 최종적으로 72 °C 에서 10분간 elongation 추가하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5 % agarose gel에서 전기영동(100 V, 25 min)하여 band의 크기를 확인하였다.

2.4. 염기서열 분석 및 계통도 작성

염기서열은 마크로젠(Korea)에서 Standard-Seq 분석을 의뢰 하였다. 염기서열 분석을 위한 시약은 BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, CA)를 사용 하였고, 분석은 ABI PRISM 3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems, CA)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI 에서 제공하는 BLAST를 이용하여 등록된 염기서열과 비 교하였다. 확인된 염기서열은 BioEdit의 Cluster W2 (^{Larkin et al., 2007})로 정렬하였고, 계통도는 MEGA 5.2 program 의 neighbor-joining tree algorithm으로 작성하였다(^{Tamura et al., 2011}).

Dolichospermum 출현 경향 분석

3.1.

2012년부터 2014년까지 북한강 수계 청평호(CP), 삼봉 (SB) 및 팔당호(P2) 지점의 Dolichospermum 출현 경향을 조사하였다(Fig. 2). 2012년 7월~ 8월까지 Dolichospermum 최대 출현량은 CP에서 16.8 × 10³ cells/mL, SB에서 19.7 × 10³ cells/mL 및 P2에서 11.1 × 10³ cells/mL였고, 수온은 19.8 ~ 33.7 °C 범위로 조사되었다. 2013년 7월~ 8월에는 CP에서 74 cells/mL, SB에서 117 cells/mL 및 P2에서 114 cells/mL 였고, 수온은 16.3 ~ 28.8 °C 범위로 조사되었다. 2014년에 는 CP에서 출현하지 않았고, SB에서 13.9 × 10³ cells/mL 및 P2에서 8.4 × 10³ cells/mL 였고, 수온은 21.1 ~ 28.3 °C 범위 였다(Fig. 2).

Fig. 2. Relationship between water temperature andDolichospermumcell density: (a) Cheongpyeong (CP), (b) Sambong (SB), (c) Paldang (P2).

2014년은 춘천지점의 강우량과 강우 일수가 2012년과 2013년도에 비해 낮았다. 북한강 상류인 춘천지점 2012년 과 2014년의 강수량은 647 mm 차이가 있었고, 2013년과 2014년 대비 1,063 mm의 차이가 나타났다. 또한 강우일수 는 2012년과 2014년의 차이가 약 21일이었고, 2013년과 2014년은 35일의 차이가 났다(Table 1). 2012년과 2013년 강우량과 강우 일수 차이는 416 mm, 14일로 크지 않았으 나, 2012년에 Dolichospermum의 증가는 의암호에서 발생하 여 북한강 수계 하류방향 댐호로 확산된 후 팔당호에서 대 량 증식되었을 것으로 판단된다(^{Byun et al., 2014}). 2014년 도에는 2012년과 2013년 대비 강우 주기와 강우량이 낮아 체류시간이 증가하여 SB와 P2에서 Dolichospermum이 출현 하였고 반면에 CP에서는 출현하지 않았다.

Dolichospermum는 수온 하강, 영양영류 부족 등의 성장 에 불리한 환경에서 휴면포자(akinete)를 만들어 퇴적층에 가라앉아 있다가 유리한 조건이 형성되면 발아하여 표층으 로 떠오른다(^{Yamamoto and Nakahara, 2009a}). 휴면포자의 발아율은 20 ~ 25 °C에서 가장 높은 것으로 보고되었다(^{Li et al., 2013}; ^{Park et al., 2014}). 초여름에 SB와 P2 지점의 수온이 20.9 ~ 24.9 °C 사이로 측정되어 휴면포자의 발아율 의 높았을 것으로 판단되며(^{Kim et el., 2015}), 강우에 의한 수체 이동 감소로 의암호에서 유입량이 줄어들어 CP에서 는 Dolichospermum이 출현하지 않았을 것으로 사료된다. 12년과 14년의 Dolichospermum 출현 경향 차이는 강우에 의한 수체의 이동에 의한 것으로, 퇴적층에서 휴면포자로 존재하다가 발아하여 증식하였을 것으로 판단된다.

3.2. 16S rRNA의 genotype 확인

북한강에서 분리된 Dolichospermum의 clone들은 목표 크 기인 699 bp에서 확인되었다. BLAST 분석 결과, 직선형인 clone들은 주로 Anabaena planctonica와 99%로 유전적으로 유사도가 높게 나타났고 나선형인 A. circinalis도 유사도가 높 았다. 나선형인 clone은 주로 Anabaena crassa와 99%로 높은 유사도를 나타내었으며, 그 외에 A. spiroides, A. circinalis, D. crassum과도 유사하였다.

Dolichospermum genotype은 형태적으로 직선형(Group A) 과 나선형(Group B)으로 분리되었다. Group A는 직선형의 염기서열들이 속하였고 Group B는 주로 나선형의 clone들 이 속하였다(Fig. 3).

Fig. 3. Phylogenetic relationships ofDolichospermumtaxa using neighbor-joining tree algorithm. The algorithm was based on partial 16S rRNA sequence (699 bp). The Clones used were isolated singleDolichospermumcell from Bukhan river.

Group A는 북한강 clone인 A'와 NCBI에 등재된 Dolichospermum 염기서열인 A"로 재분지 되었으며, Group B 도 동일하게 B'(북한강 clone)와 B'(NCBI의 염기서열)로 재 분지 되었다. A'와 B' Dolichospermum 염기서열은 염기서 열 분석 중 유실된 부분을 제외한 510 bp 내에서 대부분 3 % 이내의 차이가 나타났다. 형태적으로 나선형보다 직선형 염기서열의 변이가 많이 나타났으며, 지점 간 거리가 멀어질 수록 염기서열의 차이가 커졌다. 염기서열의 차이는 직선형이 최대 16 bp, 나선형이 17 bp의 차이를 나타내었다(Table 2).

이러한 차이는 유전적 보존성이 높은 16S rRNA의 시간 적 변이 정보를 내포한다. 유전적 변이는 16S rRNA 구조를 따라 특정 region에 집중되어 서서히 일어나기 때문에 종 (species) 간 비교에 많이 이용된다(^{Rebecca et al., 2007}; ^{Stackebrandt and Goebel, 1994}). 같은 종에서 나타나는 염 기서열의 차이는 분류학적 측면에서 다양하게 보고되고 있 으며, 동일종의 2 ~ 3 % 유전적 차이는 형태적 변이종으로 판별할 수 있을 것으로 보고하였다(^{Kim et al., 2014}).

직선형 Dolichospermum 그룹인 A'과 나선형 그룹인 B'은 북한강 내에서 각 지점마다 genotype의 차이를 나타내었으 며 가까운 지점 간에 근연관계를 내포하였다. A'는 P4를 기준으로 P2와 SC, SJ가 가까운 지점 간 클러스터(Cluster) 가 되었으며, B'는 CP, SC와 P2, P4로 가까운 지점과 다른 가지로 클러스터 되었다. 수체에서 genotype은 수심 및 지 점간의 수온, 광량, 영양염 등에 의해서 영향을 받으며 특 히 수온은 유전적 변이에 큰 영향을 주는 trigger로 작용할 수 있을 것으로 보고되었다(^{Gabrielle et al., 2003}; ^{Yang et al., 2014}) Dolichospermum 출현량은 CP, SB, P2 에서 수 온의 변화와 연관성이 높았으며, 이는 수온이 genotype에 영향을 주는 하나의 요소일 것으로 판단된다.

본 연구는 북한강에서 출현한 Dolichospermum genotype 이 3 %의 차이로 지점 간 다르다는 것을 확인하였다. 이와 같은 연구는 남조류 대발생 시 지점 별 유전자 군집구조 분석으로 genotype 다양성과 계절적 변화에 따른 유전자 풀(Gene pool)의 이동을 추적할 수 있을 것으로 판단된다.