2.1.1. 균주의 배양

실험에 사용된 균주는 이전의 실험(^{Jung et al., 2018})에서 분리하여 보관 중인 strain YG-02이며, neighbor-joining 계통 수를 Fig. 1에 나타내었다. 배지는 R2A-medium을 사용하였 고, 조성은 Table 1에 정리하였다. 각 조성성분을 투입하여 1 N NaOH 수용액을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였고 121 °C에서 30분간 멸균하여 배지로 사용하였다. 배양 온도는 22 °C에서 8일(192시간) 동안 배양하였다.

Fig. 1. Phylogenetic neighbor-joining tree of strain YG-02.

2.2.1. 배양액에 대한 응집 실험

22 °C에서 8일(192시간) 동안 배양된 strain YG-02의 배양 액 20 mL을 5,000 rpm으로 30분 동안 원심 분리하여 상등 액을 취하였다. 그리고 침전된 물질에는 0.85 % 생리식염수 를 가하여 20 mL가 되게 한 후 다시 5,000 rpm으로 30분 동 안 원심 분리하여 상등액은 제거하고 0.85 % 생리식염수를 가하여 20 mL의 양이 되게 한 후 교반하여 현탁액으로 취하 였다.

응집 실험에 사용한 슬러지는 전남 D군 하수종말처리장의 정상운영 중에 있는 산화구에서 채취하였으며 MLSS 농도는 5,000 mg/L이다. 대조군 슬러지 1 L에는 어떠한 물질도 첨가 하지 않고 자연 침전토록 하였으며, 2개의 실험군(현탁액, 상 등액)에는 슬러지 각 980 mL에 현탁액 20 mL, 원심 분리하 여 취한 상등액 19 mL을 각각 첨가한 후 충분히 교반하여 1,000 mL 메스실린더(measuring cylinder)에 부은 후 30분 동 안 침전시켜서 슬러지 침강 깊이를 측정하여 SV₃₀(mL/L)을 구하였다. SVI(Sludge Volume Index)는 MLSS 농도와 SV₃₀ 을 이용하여 아래 식 (1)에 의해 계산하였다(^{APHA, AWWA and WEF, 1998}).

2.2.2. 응집 성분의 내열성 실험

응집 실험에서와 같은 조건으로 배양된 strain YG-02의 배 양액을 5,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 온도 121 °C에서 45분간 가열 처리하였다. 실험에 사용한 슬러지는 배양액에 대한 응집 실험에서와 같은 조건의 슬러 지를 사용하여 응집 성분의 내열성 실험을 진행하였다. 대조 군 슬러지 1 L에는 어떠한 물질도 첨가하지 않았으며, 실험 군 슬러지 980 mL에 원심 분리하여 취한 상등액 20 mL을 첨가한 후 충분히 교반하여 1,000 mL 메스실린더(measuring cylinder)에 담아서 30분 동안 침전시킨 후 슬러지 침강 깊이 를 측정하여 SV₃₀(mL/L)을 구하였다.

2.2.3. 당 조성 분석

Strain YG-02의 배양액을 5,000 rpm으로 30분간 원심 분 리한 후 상등액 100 mg을 취하여 2 N TFA(trifluoroacetic acid) 용액 20 mL을 첨가하여 121 °C 온도에서 45분간 가열 처리한 후, 5,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 침전물을 제거한 뒤 syringe filter(0.2 μm pore size)로 여과하고 TFA를 제거하기 위해 50 °C에서 20배 감압 농축하였다. 완전히 농 축한 후 0.4 %의 배양액에 증류수 5 mL을 첨가하여 1.6 % 농도로 만들어서 HPLC (Shiseido Nanospace 3023 SI-2)를 이용하여 구성성분을 분석하였으며, 이때 column은 waters WAT044355, carbohydrate High performance 4 μm, 4.6*250 mm을 사용하여 column chamber의 온도를 40 °C로 조절한 뒤, mobile phase는 water와 Acetonitrile을 30 : 70으로 혼합 한 용액으로 하였으며, flow rate는 1 mL/min으로 하여 HPLC grade water를 용매로 분당 10 μL씩 용출시켜 표준당 과 비교하여 다당류가 함유하는 당류의 조성을 분석하였다. 이때, detector는 Shodex RI-501을 사용하였다. Fig. 2.

Fig. 2. Preparation of culture fluid hydrolysate.

2.2.4. 지방산 분석

Strain YG-02의 배양액을 5,000 rpm으로 30분간 원심 분리 한 후 상등액 200 mg을 취하여 Mojonnier관에 넣고 Pyrogallol 100 mg 첨가한 후, 2 mL의 내부표준용액을 첨가하였다. 내부 표준용액은 36종의 지방산 Methyl ester와 내부표준물질 (undecanoic acid methyl ester)을 Hexane에 용해시켜 각각 1 mg/mL가 되도록 조제하였다. Ethanol 2 mL을 첨가한 후 충분 히 혼합하여 8.3 M의 염산용액 10 mL을 첨가하여 잘 섞었다. Mojonnier관의 마개를 밀봉하여 70 °C의 수조에서 교반하면 서 40분간 분해하였다. Mojonnier관을 10분마다 교반기로 혼 합하여 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 하였다. 실온으로 냉각 한 후 Mojonnier관 아랫부분에 Ethanol로 채운 후 혼합하였다. Diethyl ether 25 mL을 첨가한 후 5분간 진탕하여 추출하였다. 무수 석유 Ether 25 mL을 첨가하여 5분간 진탕 추출하고 상층 이 맑아질 때까지 1시간 방치하여 분리하였다. 농축수기에 Ether층을 분액한 후 40 °C에서 감압 농축시켰다. 3 mL Chloroform과 3 mL Diethyl ether로 농축수기의 지방을 녹여 시험관으로 옮겨 담아 40 °C의 수조에서 질소 농축하여 7 % Trifluoroborane Methanol 용액 2.0 mL와 Toluene 1.0 mL을 첨가하였다. 100 °C Heating Block에서 45분간 가열한 후 실온 으로 냉각하였다. 증류수 5.0 mL와 Hexane 1.0 mL, 무수 황산 나트륨 1.0 g을 첨가한 후 진탕하여 정치하였다. 그리하여 분 리된 상등액을 취하여 무수 황산나트륨 1.0 g을 담은 Vial에 넣고 탈수하여 시험 용액으로 하였다.

조제된 시험 용액을 GC(S/N CN10643022, Agilent Technologies) 를 이용하여 분석하였으며, column은 SP-2560(100 m μ 0.25 mm μ 0.2 μm)을 사용하였고 주입부 온도는 225 °C로 하였다. 오븐 온도는 100 °C에서 4분간 유지한 후 1분 간격으로 3 °C씩 240 °C까지 가온하였고 이후 20분 동안 유지하였다. 검출기 온 도는 285 °C로 하였고 캐리어 가스는 질소가스를 사용하였다. flow rate는 1.0 mL/min으로 하였고 주입량은 1 μL(split 50:1) 씩 하였다. 지방산 함량은 식품의약품안전처의 고시인 ｢식품의 기준 및 규격｣에 의하여 구하였다.