2.1. 채수지점

한강에 위치한 서울시 취수원수 5지점을 대상으로 2018년 2월부터 2019년 1월까지 1년간 매월 시료를 채수하였고 강 우시 추가로 시료를 채수하였다. 또한 취수원수에 영향을 주 는 지류천 6지점을 대상으로 2018년 5월부터 11월 동안 매 월 시료를 채수하였고 다양한 시료에 대한 적용성을 평가하 기 위해 물재생센터 1지점을 대상으로 2020년 5월부터 6월 까지 유입수와 방류수를 채수하였다(Fig. 1). 채수한 시료는 탁도, 수온, 수소이온농도(pH) 항목을 측정하였고(^{NIER, 2017}, ²⁰¹⁸, ²⁰¹⁹), 채수 기간 동안의 강수량 자료는 기상청 홈페이지에서 수집하였다(^{KMA, 2019}).

Fig. 1. Sampling sites (■ Intake, ● Tributary, ▲ Sewage).

2.2. 분원성대장균군 검사

채수한 취수원수 113점, 지류천 42점, 유입 하수 2점 및 방 류수 9점을 대상으로 로졸릭산 용액을 넣은 m-FC 배지와 넣 지 않은 배지에 나누어 분원성대장균군을 검사하였다(^{NIER, 2017}, ²⁰¹⁸, ²⁰¹⁹). 로졸릭산 용액의 첨가 유무에 따른 분원 성대장균군 개수는 엑셀(Excel 2013)의 데이터 분석기능을 사용하여 t-test 분석으로 결과를 비교하였다.

2.3. 방해세균 영향 실험

수질오염공정시험기준에서 제시하는 분원성대장균군의 적 정 개수의 범위(20 CFU~60 CFU)에서 방해세균의 영향을 확인하기 위한 실험을 하였다. m-FC 배지에서 분리하고 동 정한 방해세균을 여과막당 (10²~10⁵) CFU(Colony Forming Units)가 되게 10 단계별로 희석하고 동시에 대장균 표준균 주(Biball, BTF, USA)를 여과막당 약 20 CFU 및 60 CFU가 되도록 넣은 시료를 조제하였다. 로졸릭산 용액을 넣은 m- FC 배지와 넣지 않은 m-FC 배지에 나누어 수질오염공정시 험기준의 분원성대장균군 검사방법에 따라서 2회 반복 실험 하였다(^{NIER, 2017}).

2.4. 세균동정

m-FC 배지에서 성장한 세균은 tryptic soy agar(Difco, USA) 에 순수 배양하여 VITEK 2 systems(bioMerieux, France)을 이용하여 동정하였고, VITEK 2 systems으로 동정이 안 되는 경우에는 염기서열분석(ABI Sequencer, Applied Biosystems, USA)을 하였다. 세균의 DNA는 QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Germany)을 사용하여 추출하였고, 16S rRNA 부위 의 프라이머 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction; ABI 9700, Biometra)을 하였다. 반응조건은 95°C, 5분, 30 cycles(94°C, 1분; 55°C, 1분; 72°C, 1분); 72°C, 7분으로 하였다. PCR 산물은 PCR purification kit(Qiagen)을 사용하여 정제하고 염기서열분석을 하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하 였다.

2.5. 군집분석

한강 하류 취수원수인 P지점을 대표로 선정하여 건기 시 채수한 시료(3월), 건기 후 봄철 강우시 채수한 시료(4월), 여 름철 강우시 채수한 시료(8월), 강우 1일 후 채수한 시료(9 월), 가을철 3일간 강우가 없었던 시기에 채수한 시료(11월) 를 비교하여 강우와 계절에 의한 세균 군집변화를 분석하였 다. 시료 1 L를 원심 분리하여 농축한 후 FastDNA™ SPIN kit for soil(MP, USA)를 사용하여 유전자를 추출하였다. 추 출한 유전자는 세균의 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭하는 프라이머(primer)를 사용하여 PCR을 하였다. 사용 한 프라이머는 341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)와 805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)이었으며, 반응 조건은 95°C, 3분, 25 cycles(95°C, 30초; 55°C, 30초; 72°C, 30초); 72°C, 5분으로 하였다. Illumina Miseq(USA) 염기서 열분석 시스템을 이용하여 chunlab, Inc.(Korea)에 의해 분석 되었다. 결과 분석은 CLcommunity 및 EzBioCloud 프로그램 (chunlab, Inc., Korea)을 이용하여 시료별 세균 군집변화를 분 석하였다(https://www.ezbiocloud.net/). Operation taxonomic units(OTUs)는 97% 유사도 기준으로 분류하였으며, 다양성 분석을 위해 Chao1, Shannon 및 Simpson 지수를 계산하였다.

3.1. 분원성대장균군 검사 결과

서울시 취수원수 113점, 지류천 42점, 유입 하수 2점 및 방 류수 9점을 대상으로 m-FC 배지에 로졸릭산 용액을 첨가한 배지와 첨가하지 않은 배지로 나누어 분원성대장균군의 결 과를 비교하였다(Table 1). 취수원수 시료에서 로졸릭산 용 액을 첨가한 배지에서 분원성대장균군이 평균 4.0 × 10¹ CFU/100 mL 으로 검출되었으나, 첨가하지 않은 배지에서는 평균 5.0 × 10¹ CFU/100 mL 으로 검출되어 로졸릭산 용액 을 첨가한 배지에서 분원성대장균군이 낮게 검출되었다. 지 류천 시료는 취수원수 시료보다 분원성대장균군이 평균적으 로 100배 이상 높게 검출되었으나, 취수원수 시료와 마찬가 지로 로졸릭산 용액을 첨가하지 않은 배지(5.5 × 10³ CFU/ 100 mL)보다 첨가한 배지(4.9 × 10³ CFU/100 mL)에서 분 원성대장균군이 낮게 검출되었다. 유입 하수 시료에서도 로 졸릭산 용액을 첨가한 배지에서 분원성대장균군이 5.7 × 10⁵ CFU/100 mL 으로 검출되었으나, 첨가하지 않은 배지에 서는 평균 6.4 × 10⁵ CFU/100 mL 으로 검출되었다. 방류수 시료도 로졸릭산 용액을 첨가하지 않은 배지(4.2 × 10³ CFU/100 mL)보다 첨가한 배지(3.7 × 10³ CFU/100 mL)에 서 분원성대장균군이 낮게 검출되었다. 이러한 결과는 로졸 릭산 용액이 분원성대장균군이 아닌 방해세균 뿐만 아니라 손상된 분원성대장균군의 성장도 억제했기 때문으로 생각된 다(^{Sartory, 1980}). 그러나 t-test 분석결과, 두 배지간의 분원 성대장균군 개수는 통계적으로 유의한 차이는 아니었다(p=0.10).

취수원수 시료로 분원성대장균군을 검사할 때, m-FC 배지 에서 자주 확인되는 방해세균을 동정하였다. Acinetobacter baumannii complex 및 Pseudomonas aeruginosa가 로졸릭산 용액의 첨가 및 미첨가 배지에서 모두 동정되었고 Kurthia sp.는 로졸릭산 용액을 넣지 않은 m-FC 배지에서만 분리되 었다. Acinetobacter 속과 Pseudomonas 속은 총대장균군 검 사시 위음성을 일으키는 세균으로 총대장균군 성장을 방해하 는 세균으로 알려져 있다(^{Franzblau et al., 1984}; ^{Lechevallier et al., 1980}). 본 연구를 통해서 이 세균들이 로졸릭산 용액 의 사용에 관계없이 m-FC 배지에서 성장하여 분원성대장균 군 성장을 방해하는 것을 알 수 있었다. 정확한 기작에 대한 연구가 향후 필요하겠지만, 분원성대장균군 배지에 로졸릭산 용액의 첨가는 분원성대장균군 검사 배지에서 성장 가능한 방해세균인 그람양성균을 억제하기 위한 것으로 알려져 있 다(^{Bronfeanbrenner et al., 1920}; ^{Geldreich et al., 1965}; ^{Presswood and Strong, 1978}). Kurthia 속은 그람양성 세균이 므로 로졸릭산 용액을 넣지 않은 m-FC 배지에서만 분리된 것으로 추정되었다(^{Bronfenbrenner et al., 1920}).

3.2. 방해세균의 영향

로졸릭산 용액을 넣지 않은 배지에서 성장하는 방해세균이 분원성대장균군 결과에 미치는 영향을 로졸릭산 용액을 넣은 배지의 결과와 비교하여 m-FC 배지에 로졸릭산 용액의 첨가 필요성을 평가하였다. m-FC 배지에서 성장하는 방해세균으 로 시료에서 분리한 아시네토박터(Acinetobacter baumannii complex)를 여과막 당 10² CF 부터 10⁵ CFU가 되게 10 단 계별로 넣고 대장균 표준균주를 여과막 당 약 20 CFU와 60 CFU가 되도록 섞은 시료를 조제하여 로졸릭산 용액을 첨가 한 배지와 첨가하지 않은 배지로 나누어 분원성대장균군 실 험을 하였다. 실험결과, 방해세균이 여과막에 10³ CFU 존재 할 경우 분원성대장균군의 집락이 작아지고 뚜렷하지 않게 되었으며, 10⁴ CFU 이상 존재시 집락이 더 작아지고 파란색 집락 색깔이 옅어져서 계수하기 어려웠다(Fig. 2). 또한 대장 균 표준균주를 여과막 당 약 30 CFU가 되도록 넣은 시료에 Kurthia sp.를 여과막 당 약 1.5 × 10², 4.5 × 10², 7.5 × 10², 1.1 × 10³, 1.5 × 10³, 1.8 × 10³ CFU가 되게 단계별로 넣고 분원성대장균군을 실험한 결과, Kurthia sp.가 여과막에 1.1 × 10³ CFU 이상 포함시 분원성대장균군 집락이 뚜렷하지 않 았다(Fig. 3).

Fig. 2. Effect ofAcinetobacter baumanniicomplex in medium without/with rosolic acid solution. (a) fecal coliforms 20 CFU/filter, (b) fecal coliforms 60 CFU/filter.

Fig. 3. Effect ofKurthiasp. in medium without rosolic acid solution (fecal coliforms 30 CFU/filter).

따라서 수질오염공정시험기준에 제시된 대로 여과막에 20 CFU~60 CFU의 분원성대장균군 집락이 형성되도록 실험을 할 경우, 여과막에 분원성대장균군이 아닌 세균이 10³ CFU 이상 과다하게 존재하면 분원성대장균군의 성장을 억제하거 나 파란색 집락 형성을 방해하는 것으로 생각되었다. 이러 한 결과는 막여과법으로 총대장균군을 검사할 경우, 일반세 균 수가 1,000 CFU/mL를 초과하면 총대장균군수가 감소한 다는 이전의 연구결과와 유사하였다(^{Amanidaz et al., 2015}; ^{Geldreich et al., 1972}). 다만 본 연구결과에서는 여과막 당 일반세균수가 1,000 CFU를 초과시 분원성대장균군수가 감 소하였으므로 막여과법으로 분원성대장균군을 검사할 경우 에는 mL 당 일반세균수 보다는 여과막 당 분원성대장균군 배양 온도인 44.5°C에서 성장 가능한 일반세균수를 고려하 는 것이 더 적합하다고 판단되었다.

로졸릭산 용액의 첨가 및 무첨가 배지에서 수온에 따른 방해세균 및 분원성대장균군의 성장 차이를 분석하였다. Table 2에는 계절에 따른 비교를 위해 1월, 4월, 8월, 11월 에 채수한 취수원수 시료(J, P 지점) 및 5월, 8월, 11월에 채 수한 지류천 시료(DM, WM, DS 지점)의 결과를 나타내었 다. 강우의 영향을 최대한 배제하기 위해 채수당일 및 채수 전날 강우가 없었던 시료만을 비교하였다. 1월에 채수한 취 수원수 시료는 로졸릭산 용액의 첨가 유무에 상관없이 한 번에 50 mL 이상의 시료를 여과하여도 방해세균의 영향없 이 분원성대장균군을 계수할 수 있었다. 낮은 수온으로 세 균의 성장이 둔화되어 방해세균의 영향이 없었던 것으로 추 정되었다(Table 2). 4월 시료는 로졸릭산 용액의 첨가 및 무 첨가 배지 모두에서 방해세균이 이전보다는 더 많이 성장하 였다. 분원성대장균군이 20 CFU/100 mL 미만으로 검출되 는 상류 지점(G, K 지점)에서는 분원성대장균군을 검출하기 위해 시료량을 한번에 100 mL로 늘리면서 로졸릭산 용액을 첨가하지 않은 배지에서 일부 방해세균이 퍼져서 성장하였 다(data not shown). 방해세균의 영향은 100 mL의 시료를 2 개~3개의 여과지에 나누어 실험하였을 때, 감소하였다. 동 일 시기의 하류 지점(A, J, P 지점)에서 채수한 시료는 상류 보다 약 1/2~1/10 정도의 시료량으로도 여과지에 20 CFU 이상의 분원성대장균군이 검출되었고 방해세균의 영향도 없 었다(Table 2). 8월에 채수한 시료는 여과막에 방해세균이 많이 성장하였고 로졸릭산 용액을 넣지 않은 배지에서 성장 한 분원성대장균군의 일부 집락이 뚜렷하지 않았다(Table 2). 11월에 채수한 시료는 4월에 채수한 시료와 같이 적정 개수의 분원성대장균군을 검출하기 위해 시료량을 늘리면서 로졸릭산 용액을 첨가하지 않은 배지에서 일부 방해세균이 퍼져서 성장하였다(Table 2). 따라서 취수원수 시료는 동절 기에는 로졸릭산 용액을 넣지 않은 배지로 분원성대장균군 검사를 할 수 있었으나, 수온이 높아지는 여름철은 방해세 균의 성장이 활발하게 이루어지는 시기이므로 분원성대장균 군의 뚜렷한 집락을 얻기 위해서는 로졸릭산 용액이 첨가된 배지를 사용하는 것이 적합하였다. 4월 및 11월에도 로졸릭 산 용액을 넣지 않은 배지의 사용이 가능하였으나, 분원성 대장균군이 20 CFU/100 mL 미만으로 검출되는 지점에서는 시료량 증가에 따른 방해세균의 영향을 줄이기 위해 여러 개의 여과막에 시료를 나누어 실험하는 것이 필요하였다.

Table 2. Effect of season in intake, tributary and sewage samples.

지류천 시료는 0.01 mL~0.1 mL의 시료량으로도 적정 범 위의 분원성대장균군수를 얻을 수 있었다. 5월, 8월, 11월에 채수한 시료 모두에서 로졸릭산 용액을 넣지 않은 배지에서 방해세균의 영향없이 분원성대장균군의 집락이 뚜렷하게 관 찰되어 로졸릭산 용액을 넣지 않은 배지로 분원성대장균군 검사가 가능하였다(Table 2). 유입 하수 시료는 0.005 mL~ 0.01 mL의 시료량, 하수 방류수 시료는 0.1 mL~5 mL의 시 료량으로 적정 범위의 분원성대장균군수를 얻을 수 있었다. 모든 하수 시료에서 로졸릭산 용액을 넣은 배지와 같이 로졸 릭산 용액을 넣지 않은 배지에서도 방해세균의 영향이 없었 고 분원성대장균군의 파란 집락이 뚜렷하였다. 하수 시료는 시료수가 적고 조사기간이 짧아 더 연구가 필요하겠지만, 검 사한 시료에서는 로졸릭산을 넣지 않은 배지로 분원성대장 균군 검사가 가능하였다(Table 2). 막여과법에 의한 분원성 대장균군 검사에 로졸릭산 용액을 넣지 않은 m-FC 배지를 사용 할 수 있다는 결과는 미국, 남아프리카 공화국 등 국외 의 여러 연구에서 제시된 바 있다(^{Grabow et al., 1981}; ^{Presswood and Strong, 1978}; ^{Sartory, 1980}).

5월부터 9월 사이 채수된 시료에 대해 강우에 의한 방해세 균의 영향을 조사하였다(Table 3). 채수 당일 강우량이 6.5 mm이었던 5월에 채수된 취수원수 시료(전날 12.5 mm)는 로 졸릭산 용액을 첨가한 배지와 달리 첨가하지 않은 배지에서 는 방해세균의 영향으로 분원성대장균군 집락을 뚜렷하게 확인하기 어려웠다. 그러나 채수 1일 전에도 80 mm 이상의 강우가 있었고 당일에도 강우량이 50 mm 이상이었던 7월에 채수한 시료는 로졸릭산 용액의 첨가 및 무첨가 배지 모두에 서 분원성대장균군의 뚜렷한 집락을 관찰할 수 있었다. 채수 당일 강우량이 6.5 mm이었던 8월에 채수된 시료(전날 8.5 mm)는 배지에 로졸릭산 용액의 첨가 유무에 상관없이 분원 성대장균군의 뚜렷한 집락을 관찰하기 어려웠다. 반면 같은 지점에서 강우가 없었던 8월에 채수한 시료(Table 2)는 시료 량(10 mL)이 같았으나, 분원성대장균군의 집락은 강우가 있 었던 8월 시료보다 뚜렷하였다. 따라서 분원성대장균군 검사 에서 강우에 의한 방해세균의 영향이 있었음을 알 수 있었 다. 당일 강우량이 34.5 mm 이었던 9월 시료는 로졸릭산 용 액의 첨가 및 무첨가 배지 모두에서 방해세균이 있었으나, 분원성대장균군의 계수를 방해할 정도는 아니었다(Table 3). 강우량이 많을 경우에는 강우시 토사 등을 통해 유입된 세균 이 많은 강우로 인해 빨리 희석되는 효과가 있어 분원성대장 균군 검사에서 방해세균의 영향이 적었으나, 강우량이 적었 던 5월, 8월 시료는 강우로 인해 유입된 세균의 희석효과가 크지 않아 분원성대장균군 검사 시에 방해세균으로 작용했 을 것으로 추정되었다. 특히 5월 시료는 로졸릭산 용액을 넣 지 않은 배지에서만 성장 가능한 그람양성균의 영향이 있었 던 것으로 생각되었다.

Table 3. Effect of rainfall in water intake, tributary and sewage samples.

채수 당일 강우(5 mm)가 있었거나, 채수 2일 전 강우(34.5 mm)가 있었던 지류천 시료는 로졸릭산 용액의 첨가 및 무첨 가 배지 모두에서 방해세균 영향 없이 뚜렷한 분원성대장균 군의 집락을 관찰할 수 있었다(Table 3). 채수 당일 강우(2 mm)가 있었던 하수 유입시료도 로졸릭산 용액의 첨가 유무 에 상관없이 방해세균의 영향이 없었고 뚜렷한 분원성대장균 군의 집락을 관찰할 수 있었다(Table 3). 하수 방류수도 채수 당일 강우(29.8 mm)가 있었으나 로졸릭산 용액의 첨가 및 무 첨가 배지 모두에서 방해세균의 영향이 없었다(Table 3). 따 라서 강우에 의한 방해세균의 영향은 지류천, 하수 보다 취수 원수 시료에서 더 크게 작용하였다. 조사기간 동안 취수원수, 지류천 및 하수 방류수의 평균 분원성대장균군수(로졸릭 용 액 무첨가 배지)는 100 mL 당 각각 5.0 × 10¹ CFU, 5.5 × 10³ CFU 및 4.2 × 10³ CFU 로 검출되어 지류천, 하수 방류 수가 취수원수 보다 분원성대장균군수가 약 100배 정도 높았 다(Table 1). 그러므로 막여과법에서 분원성대장균군의 적정 개수(20 CFU~60 CFU)의 결과를 얻기 위해서 취수원수는 지류천 및 하수 방류수 보다 많은 시료량의 여과가 필요하였 고 그만큼 방해세균의 영향이 컸던 것으로 추정되었다.

강우에 의한 세균 군집변화를 비교하기 위해 건기시 채수 한 시료(p-3), 건기 후 봄철 강우시 채수한 시료(p-4), 여름철 강우시 채수한 시료(p-8), 강우 다음날 채수한 시료(p-9) 및 선행 3일간 강우가 없었던 시기에 채수한 시료(p-11)에 대해 차세대 염기서열 분석을 하였다(Table 4). 시료 내에 존재하 는 종의 수(operational taxonomic unit, OTU; similarity 97%) 는 p-4와 p-8 시료에서 각각 1163 및 1127로 높았으며, p-3 시료에서 760으로 가장 낮았다. Chao1 및 Shannon값도 p-4 시료에서 가장 높아서 시료 내 종의 다양성이 풍부한 것으 로 나타났다. Simpson 계수는 p-3 시료에서 상대적으로 높 아 다른 시료보다 우점도가 높게 나타났다(Table 5). 군집분 석 결과는 생물분류 체계에 따라서 세균의 가장 넓은 범위 인 문(phylum) 수준과 두 번째로 좁은 범위인 속(genus) 수 준에서 분석하였다. 당초 가장 좁은 범위인 종(species) 수 준에서 구성비를 검토하고자 하였으나, unidentified bacteria 가 많이 동정되어 종(species) 수준 보다 속(genus) 수준에 서 구성비를 검토하였다. 문(phylum) 수준에서 분석한 결 과, Proteobacteria와 Bacteroidetes가 세균 구성의 50% 이상 을 차지하였다(Table 6). Actinobacteria 비율은 p-8 및 p-9 시 료에서 20% 이상으로 높았고, Bacteroidetes 비율은 p-3 시료 에서 가장 높았고 p-8 시료에서 가장 낮았다. Cyanobacteria 구성비는 p-8 시료에서 가장 높았는데 수온이 높을 때 왕성 하게 성장하는 계절적인 특성인 것으로 생각되었다. 속 (genus) 수준에서 분석하였을 때, p-8 시료에서 다른 시기에 채수한 시료보다 Anabaena 속의 구성비가 최소 12배에서 최 대 210배 이상 증가하였다(Table 6). p-4 시료는 다른 시기에 채수한 시료보다 Pseudomonas 속의 구성비가 최소 64배에 서 최대 190배 이상 증가하였다. 또한 1% 미만의 구성비라 Table 6에 표시되지는 않았지만, Acinetobacter 구성비도 p-3 시료 보다 p-4 시료에서 60배 이상 증가하였다. 세균 군집분 석 결과, 봄철 강우 및 여름철 강우시 세균의 다양성이 증가 하여 분원성대장균군 실험시 방해세균으로 작용했을 것으로 추정되며, 특히 분원성대장균군 실험시 방해세균으로 확인되 었던 Pseudomonas와 Acinetobacter는 건기 이후 봄철 강우 시 구성비가 크게 증가하는 것을 알 수 있었다.

결과적으로 검사한 취수원수 시료 113점, 지류천 시료 42 점, 유입 하수 2점 및 방류수 9점 중 취수원수 21점에서는 로졸릭산 용액을 넣지 않은 m-FC 배지에서 수온 상승 및 강 우로 인한 방해세균의 영향이 있었다. 이를 제외한 145점(약 87%)은 로졸릭산 용액을 넣지 않은 m-FC 배지를 사용하여 분원성대장균군 검사를 할 수 있었다. 실제로 검사하는 시료 의 특성 및 종류에 따라 다를 수 있겠지만 본 연구에서 검사 한 시료를 기준으로 할 때, 분원성대장균군 검사에 소요되는 로졸릭산 용액(로졸릭산 및 수산화나트륨)의 비용 또한 87% 정도 절약할 수 있을 것으로 판단되었다. 비용 측면이외에도 환경, 검사시간 등을 고려한다면 물 시료에 대해 막여과법으 로 분원성대장균군 검사를 할 경우에는 시료의 특성에 따른 배지 사용이 바람직하다고 생각되었다.