2.1 실험 균주 분리 및 배양

연구에 사용된 균주 Ulnaria ulna는 2017년 3월 금호강 대부 잠수교 지점 (N 35° 53′50.8″, E 128° 48′5.6″)에서 채수하여 순수 분리하였다. 균주의 동정은 ^{Krammer and Lange-Bertalot (1986}; ¹⁹⁸⁸; ^1991a; ^1991b)와 ^{Lange-Bertalot and Compère (2001)}를 이용하였다. 분리된 종들은 100 mL의 DM medium (^{Beakes et al., 1988})이 각각 담긴 250 mL Erlenmeyer flask에서 20±2℃의 온도와 120 μm m^-2 s^-1 (LI-250 Light MEter, LI-COR. U.S.A)의 광량, 18h^L:6h^D의 광주기를 지속적으로 유지하며 진탕배양기 (Hanbaek, HB- 201SLI)에서 반연속 회분식 배양방식으로 전배양 (pre-culture)하였다.

2.2 중금속에 따른 Ulnaria ulna의 성장률 조사

시험 물질로는 수계 유해물질 중 인간이나 동식물에게 직접 또는 간접적인 영향을 미치는 물질로 지정된 28종의 특정수질유해물질 중의 중금속 4 종 (Cu, Cd, Pb, As)과 각종 화학산업에서 높은 사용량을 보이며 인간이나 동식물에게 미치는 독성영향정도 등의 고려사항에서 높은 우선순위를 보이는 중금속 1 종 (Zn)을 추가하여 총 5종의 중금속을 선정하였다.

실험에 사용된 중금속은 납 (PbCl₂, Sigma-Aldrich Co., LLC., USA), 카드뮴 (CdCl₂, Sigma-Aldrich Co., LLC., USA), 아연 (ZnCl₂, Sigma-Aldrich Co., LLC., USA), 비소 (AsNaO₂, Sigma-Aldrich Co., LLC., USA), 구리 (CuCl₂.2H₂O, Sigma- Aldrich Co., LLC., USA)이었다. 중금속의 주입 농도는 낙동강 수계 내 위치한 산단 하천의 2016년 현장 조건을 고려하여 0 (대조구), 0.01, 0.1, 2 mg L^-1로 설정하였다 (^{ME, 2017}).

약제는 증류수에 중금속을 용해시킨 표준용액 (1,000 ppm)을 준비한 후, 희석해서 사용하였다. 250 mL Erlenmeyer flask에 멸균된 DM medium 200 mL를 주입한 후, 설정된 농도 별로 각 중금속을 첨가하여 1 시간 동안 안정화시켰다. 배양액에서 배양된 지수성장기의 Ulnaria ulna를 각 flask에 세포 농도 약 4.5 × 10³ cell mL^-1로 접종하였다. 접종 후 앞서 설명한 배양조건을 동일하게 유지하며 실험을 진행하였으며, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 간격으로 1 mL씩 채수하여 3회 계수하였고, 시간에 따른 각 실험군별 Ulnaria ulna의 성장률 (μ)은 아래의 식과 같이 계산하였다 (^{APHA, 2005}).

μ (d^-1) = ln (X₂/X₁)/(T₂-T₁)

X₁: 초기 세포밀도 (cells mL^-1)

X₂: T₂ 시간 경과 후 세포밀도 (cells mL^-1)

(T₂-T₁): 배양실험 경과 시간 (day)

2.3 중금속에 따른 Ulnaria ulna의 형태 변이도 조사

Ulnaria ulna의 형태 변이종 조사는 앞서 설명한 배양조건을 유지하며, 7 일, 14 일, 21 일, 28 일 후 각 flask 마다 40 mL씩 채수하여 영구 표본을 제작하였다. 시료의 세정은 KMnO₄ 법 (^{Hendey, 1974})을 사용하였고, Pleurax로 봉입하였다. 제작된 슬라이드는 Nikon Eclipse 80i 광학 현미경으로 400~1000 배하에서 관찰하였고, 100 ~ 500 개체 당 출현한 형태 변이종을 계수하여 출현빈도를 구하였다. 또한 ^{Falasco et al. (2009)}의 연구를 참고하여 출현한 형태 변이종을 다음과 같은 4 가지 유형으로 나누어 그 출현 빈도를 조사하였으며, Nikon DS-5M 디지털 카메라로 촬영하였다.

유형 1 : 뚜껑 (valve)의 비정상적인 외형

유형 2 : 점무늬열 (striations)의 불균일한 분포 및 불규칙인 분지

유형 3 : 세로축역 (longitudinal area)의 변이

유형 4 (복합형) : 단일 피각 (frustules) 내 두 개 이상의 유형이 존재

2.4 통계분석

실험군간 각 분석항목의 차이에 대한 통계적 유의성을 검증하기 위하여 일원분산분석 (one-way ANOVA)을 실시하였으며, 실험군간 차이는 Tukey’s HSD test를 사용하여 사후검정 하였고, 유의 수준은 P<0.05를 기준으로 하였다 (SPSS Inc., v. 18.0).

3.1 중금속에 따른 Ulnaria ulna의 성장 변화

조사 기간 동안 모든 샘플에서 Ulnaria ulna의 세포밀도는 시간이 경과함에 따라 증가하였으며, 0 → 14일까지는 개체 밀도가 4,500~최대 17,600 cells mL^-1의 범위로 그 증가폭이 적었던 반면, 14 → 28일까지는 17,600~최대 81,700 cells mL^-1의 범위로 이전에 비해 대폭 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1). 개체 밀도는 또한 대조군과 실험군 사이에서도 큰 차이를 보였는데, 대조군 (중금속 주입 농도 0 mg L^-1)의 개체 밀도는 평균 30,668 cells mL^-1이었던 반면, 실험군 (중금속의 주입 농도 0.01, 0.1, 2mg L^-1)의 개체 밀도는 평균 19,785 cells mL^-1로 조사되어 대조군에 비해 크게 감소한 것으로 나타났다. 특히 카드뮴 (Cd)과 비소 (AS)의 경우, 대조군에서 각각 평균 30,880 cells mL^-1와 29,640 cells mL^-1의 개체 밀도를 보였으나, 최대 농도 2 mg L^-1에서는 각각 평균 21,700 cells mL^-1와 10,680 cells mL^-1의 개체 밀도를 보여 타 중금속에 비해 가장 큰 폭으로 감소하였다. 이렇듯 중금속을 주입하지 않은 대조군에 비해 중금속을 주입한 실험군의 개체 밀도가 낮게 조사된 것은 중금속 유입이 부착규조의 생육에 생물학적 스트레스 요인으로 작용하여 개체군의 성장을 저해한 것으로 판단된다 (^{Cantonati et al., 2014}; ^{Duong et al., 2010}; ^{Luis et al., 2011}).

Fig. 1. Change of the cell growth in theUlnaria ulnain situ on heavy metal injection concentrations. Results shown are the means of three replicates.

Ulnaria ulna의 성장률은 중금속의 종류에 따라 차이를 보이는 것으로 나타났다 (Table 1). 카드뮴 (Cd)과 비소 (As)의 경우, 최대 농도 2 mg L^-1에서 각각 0.049 day^-1와 0.048 day^-1의 성장률을 보이며 타 중금속에 비해 대조군 (μ=0.099 day^-1(Cd), μ=0.097 day^-1(As))에 비하여 가장 큰 폭으로 감소하였다. 이 두 중금속은 통계적으로도 농도와 개체군 성장률 간의 유의미한 차이를 보이는 것으로 나타났으며 (p=0.021(Cd), p=0.002(As)), 사후분석 결과 또한 대조군과 2 mg L^-1 농도 사이에 통계적으로 뚜렷하게 구분되는 특징을 보였다. 구리 (Cu)와 아연 (Zn)의 경우, 최대 농도 2 mg L^-1에서 각각 0.073 day^-1, 0.069 day^-1의 성장률을 보이며 대조군 (μ=0.100 day^-1)에 비해 소폭 감소하는 경향을 나타냈다. 납 (Pb)은 2 mg/L의 농도에서 0.090 day^-1의 성장률을 보이며 타 중금속과 비교하여 대조군 (μ=0.102 day^-1)에 비해 극히 낮은 감소율을 보였다. 규조류의 성장에 요구되는 필수 중금속 (Fe, Zn 및 Cu)등은 개체 성장, 광합성 및 호흡 과정을 위해 규조류에 흡수되어 사용된다. 하지만 규조류인 Thalassiosira weissflogii가 0.065 ㎍ L^–1이상의 Zn 농도에서부터 성장에 영향을 받는다는 보고에서와 같이 (^{Anderson et al., 1978}), 조류 성장을 위한 필수 중금속 농도의 최적 범위는 일반적으로 낮다 (^{Filippis and Pallaghy, 1994}; ^{George, 1990}; ^{Martin and Coughtrey, 1982}). 따라서 중금속은 극히 미량일지라도 부착규조의 물질대사를 방해하여 성장 저해를 유발할 수 있으며, 비필수 중금속 (Hg, Cd, Pb, As 등)이 필수 중금속에 비해 더 낮은 농도에서도 부착규조의 성장에 영향을 미친다 (^{Morin, 2003}). 특히 Cd과 As는 미량일지라도 생물체 내로 유입될 경우 다른 오염물질에 비해 상대적으로 긴 반감기를 가지며 (^{Phillips, 1980}; ^{Phillips and Segar, 1986}), 효소에 필요한 필수 금속군 대신 결합하여 효소의 활성 저해 및 생리적 장해를 유발한다 (^{Simkiss et al., 1982}).

^{Hwang et al. (2014)}는 해산 규조류 (Skeletonema costatum)의 성장에 중금속 (Cd, Cu, Zn)이 미치는 영향에 대해 분석하였으며, 중금속 농도의 증가에 따라 세포밀도가 유의미하게 감소함을 밝혔다. 그러나 각 중금속에 따른 규조류 성장에 대한 영향은 본 연구와 차이를 보였으며, 특히 Cd과 As에 의해 가장 큰 영향을 받은 Ulnaria ulna와 달리, S. costatum는 Cu와 Zn에 의해 가장 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 이는 개체군별 중금속의 특이성에 의한 결과로 판단되며, 향후 추가연구를 통해 중금속별 지표종을 선정하는 주요한 자료가 될 수 있을 것으로 사료된다.

3.2. 중금속에 따른 Ulnaria ulna 형태 변이종의 출현 양상

조사 시기별 Ulnaria ulna의 형태 변이율을 살펴본 결과, 시간의 경과에 따라 형태 변이종의 출현 비율이 증가하는 것으로 나타났다. 조사 시기별 형태 변이율은 28일째 가장 증가한 Pb을 제외하고 나머지 4 종류의 중금속은 모두 21일째 그 증가폭이 가장 큰 것으로 조사되었다.

본 연구에서는 중금속이 규조 피각의 형태적 변이를 야기하는 요인으로 작용하였으며, 중금속의 종류에 따라 그 형태 변이율에 뚜렷한 차이를 보였다. 또한 통계적으로도 Pb을 제외한 4개 중금속에서 형태 변이종의 농도별 출현비율에 유의미한 차이가 있는 것으로 나타났다. 가장 큰 형태 변이율을 보인 중금속은 As와 Cd이었으며, 다음으로 Zn, Cu, Pb 순이었다 (Table 2). Cd과 As의 경우, 0.01 mg L^-1의 농도에서 Ulnaria ulna의 형태 변이율이 각각 평균 2.46 %와 2.16 %이었으며, 0.1 mg L^-1의 농도에서는 평균 5.11 %와 5.28 %, 2 mg L^-1의 농도에서는 10.41 %와 10.13 %로 각각 조사되어 주입 농도가 높을수록 형태 변이율이 대폭 증가하는 것으로 나타났다 (p=0.005(As), p=0.009(Cd)). Zn과 Cu, Pb은 0.01 mg L^-1의 농도에서 각각 평균 1.74%, 0.62%, 0.15% 순으로 나타났으며, 0.1 mg L^-1의 농도에서 3.28%, 1.84%, 0.88% 순으로, 최대 농도인 2 mg L^-1에서 6.94%, 5.67%, 3.31% 순으로 나타났다. 이를 통해 Cd과 As가 Zn, Cu, Pb과 비교하여 부착규조의 형태 변이를 유발하는데 더 큰 영향을 미치는 것으로 판단되었다. ^{Morin et al. (2008)}은 0.1 mg L^–1 이상의 Cd 농도에서부터 부착조류의 형태 변이종이 출현하였다고 보고하였으나, 본 연구에서는 Cd과 As의 경우 선행연구에서보다 더 낮은 농도인 0.01 mg L^–1 농도에서 1 % 이상의 형태 변이율을 보였다. Zn과 Cu 역시 농도에 따라 출현한 형태 변이종이 점차 증가하였는데 (p=0.025(Zn), p=0.016(Cu)), 1 % 이상의 형태 변이율을 보인 농도는 Zn의 경우, 0.01 mg L^-1(1.74 %), Cu는 0.1 mg L^-1(1.84 %)이었다. ^{Cattaneo et al. (2004)}는 2 mg L^-1 이상의 Cu 농도에서 부터 Ulnaria tenera의 형태 변이종이 관찰되었다고 언급하여 본 연구 결과와 차이를 보였다. Pb의 경우, 최고 농도인 2 mg L^-1에서 평균 3.31 %의 형태 변이율을 보이며 타 중금속에 비해 그 변화폭이 가장 작은 것으로 조사되었다. ^{Pandey et al. (2014)}는 부착규조의 형태 변이율과 Cu 및 Zn 농도 간에 통계적으로 유의미한 양의 상관성을 보여 주었으나 Pb에 노출된 경우에는 상관성이 낮은 것으로 보고하였으며, 이는 Cu와 Zn에 비해 Pb이 기질로부터 매우 느리게 용해되기 때문일 것이라 하였다. ^{Rai et al. (1981)}는 Cu와 Zn이 부착생물 군집에 상당한 영향을 미치지만 Pb은 그에 비해 생물 군집에 독성이 낮다고 언급하였다. 본 연구에서도 Pb은 다른 4개의 중금속에 비해 형태 변이율이 가장 낮게 조사되어 부착규조의 성장에 비교적 영향이 적은 중금속일 것으로 판단되었다 (Fig. 2). 이러한 중금속의 노출과 관련된 형태 변이종의 출현 이외에 다양한 환경 조건의 변화에 따른 보고들도 있었다. ^{Antoine and Benson-Evans (1984)}에 따르면 낮은 유속과 흐름 상태, 가뭄 조건, 높은 조도 및 수온이 규조류 피각의 형태적 변이와 밀접한 관련이 있으며, 주로 비정상적인 피각 외형과 불규칙한 점무늬열 패턴을 보였다고 하였다. ^{Barber and Carter (1981)}은 규조류가 성장하는데 낮거나 높은 pH 조건이 피각의 형태적 변이를 유발하며, 이는 Fragilaria virescens (매우 낮은 pH 조건, 3)와 Nitzschia sinuata (높은 pH 조건, 8.5)에서 나타났다고 보고하였다. ^{Aleem (1950)}은 염분 농도가 높은 연안에서 Navicula cryptocephala, Synedra tabulate 및 S. hyperborea의 피각 비대칭 및 뒤틀림을 보였다고 하였으며, ^{Stoermer and Andresen (2006)}은 염분이 높은 조건에서 Tabularia 속의 피각 비대칭 및 비정상적인 점무늬열 패턴, 불규칙한 가장자리를 보였다고 하였다. ^{Feldt et al. (1973)}은 시안화물, 다환 방향족 탄화수소 (PAH) 및 농약과 같은 독성 화합물이 피각의 형태적 변이를 유발한다고 하였으며, ^{Szabo et al. (2005)}는 헝가리 티사강 (Tisza River)에서 2000년 2월과 이른 봄에 많은 양의 시안화물과 중금속에 의해 심하게 오염되었는데, 이 때 Cyclotella atomus, C. meneghiniana와 C. pseudostelligera에서 비정상적인 피각 외형을 보였고, 주로 점무늬열 패턴이 정상 세포와 달랐다고 하였다. ^{Falasco et al. (2009)}은 실험실의 인공 조건에서 장시간 배양된 규조류 세포에서 형태적 변이를 일으킨 피각이 종종 발견되었다고 하였다. 실험실의 비 자연적 성장 조건이 조류 세포에 대한 스트레스를 나타낼 수 있으며, 주로 세포 성장에 영향을 미치는 변수는 부적합한 배지 (^{Hostetter and Rutherford, 1976}; ^{Schmid, 1975}, ¹⁹⁷⁹) 또는 삼투압 스트레스 (^{Schmid, 1979}, ¹⁹⁸⁰, ¹⁹⁸⁴; ^{Schultz, 1971}), 장시간 노출에 따른 과밀집 (^{McMillan and Johansen, 1988}) 등이 형태 변이를 일으킬 수 있다고 하였다. 본 연구의 몇몇 대조군 시료에서도 형태 변이종이 출현하였는데 이는 이전 연구들에서 보고된 대조군의 형태 변이율 범위에 속하였다 (^{Arini et al., 2012}; ^{Duong et al., 2008}). 대조군에서 관찰된 세포의 변이율은 0.01 - 0.02 %로 낮은 값을 보였으며, 4 주차의 시료에서 모두 관찰되었다. 대조군에 출현한 형태 변이종이 모두 4 주차의 시료에서 관찰된 점을 미루어 볼 때 장시간에 걸친 배양이 영향을 미친 것으로 판단되었다.

Fig. 2. Percentage of defromed cells in theUlnaria ulna exposured to heavy metal stress during 28 days.

결과적으로 본 연구를 통해 중금속의 농도와 부착규조 형태 변이종의 출현비율에 간에 유의미한 상관관계가 있었으며, 중금속의 주입 농도가 높을수록 형태 변이율이 증가하는 것으로 나타났다. 이는 하천 내 중금속 오염도의 평가 지표로서 부착규조의 형태 변이율에 대한 적용 가능성을 시사한다. 중금속에 따른 형태종의 출현비율은 Cd > As > Zn > Cu > Pb 순으로 나타났으며, 이는 Cd과 As가 Cu, Zn, Pb에 비해 비교적 부착규조의 성장에 더 큰 영향을 미치는 중금속으로 판단되었다. 또한 현장 시료에서 부착규조의 형태 변이율이 10 % 이상 차지할 경우 그 대상 하천의 중금속 농도가 2 mg L^-1 이상 검출될 가능성이 있으므로 중금속 오염에 대한 정밀조사가 필요할 것으로 사료되었다.

Fig. 4. Normal and abnormal frustules accoding to four types of theUlnaria ulna.(A) : normal type; (B) : abnormal type; (Type 1) : deformed valve outline; (Type 2) : defromed striations; (Type 3) : deformed longitudinal area; (Type 4) : mixed deformities (more than one type of deformity in the same frustules); scale bar = 10㎛.

3.3 Ulnaria ulna 형태변이종의 유형별 출현 특성

형태 변이율이 가장 높았던 28일차 조사를 대상으로, 출현한 형태 변이종을 4 가지 유형 별로 나누어 그 출현빈도를 살펴보았다 (Fig. 3). 실험군인 5가지 중금속에서 모두 valve(뚜껑)의 비정상적인 외형 (outline)을 갖는 유형 1이 평균 43.4 %를 차지하며 가장 많은 것으로 조사되었다. 다음으로 점무늬열 (striations)에 변이를 보이는 유형 2가 평균 29.1 %를 차지하며 많았다. 유형 1은 주로 뚜껑 (valve) 외형이 물결모양 (wavy)을 이루거나, 일부분이 잘리거나 (incised), 구부러지는 (bent) 형태를 보였으며, 유형 2는 점무늬열 (striations)이 불규칙적인 분포 (irregularly distributed)를 갖거나, 갈래가 생기거나 (forked), 혹은 물결모양을 이루는 점무늬열 패턴 (wavy striation patterns)이 현미경을 통해 관찰되었다. 중금속 별로 살펴본 결과, Cd과 As의 경우, 유형 1이 전체 형태 변이종의 47.7 %와 43.9 %를 각각 차지하였으며, 다음으로 유형 2가 전체의 22.6 % (Cd), 26.2 % (As), 세로축역 (longitudinal area)의 비정상적인 형태를 갖는 유형 3이 19.5 % (Cd), 16.8 % (As), 단일 뚜껑 (valve) 내 두 개 이상의 유형이 존재하는 유형 4 (복합형)가 10.3 % (Cd)와 13.2 % (As)를 각각 차지하였다. Zn과 Pb의 경우, 유형 1이 전체 형태 변이종의 41.9 %와 40.4 %를 각각 차지하였고, 유형 2가 33.7 % (Zn), 33.9 % (Pb), 유형 3이 3.5 % (Zn), 6.4 % (Pb), 유형 4가 21.0 % (Zn), 19.3 % (Pb)를 각각 차지하였다 (Fig. 3-4). Zn과 Pb은 타 중금속에 비해 유형 2와 유형 4의 비율이 비교적 높은 것으로 나타난 반면, 유형 3은 Zn과 Pb에 비해 Cd과 As에 노출된 경우에 더 많이 발견되었으며, 주로 구부러지거나 (curved), 변위된 (displaced) 세로축역 (longitudinal area)의 형태를 보였고, Cu는 모두 유형 1에서만 관찰되었다. 이는 Zn에 노출된 부착규조의 경우 유형 2와 유형 4 (복합형)에 해당하는 형태 변이가 타 중금속에 비해 더 많이 발생하였다는 ^{Pandey et al. (2014)}의 연구 결과와 일치하였으며, 실험을 통해 Cu에 노출된 경우 부착규조 뚜껑 (valve)의 내부 무늬 (ornamentations)와 패턴은 변하지 않은 채 외형 (outline)에만 형태 변이가 유발하였다는 ^{Falasco et al. (2009)}의 연구 결과와도 일치하는 것으로 나타났다.

Fig. 3. Percentage of four different types of deformities in theUlnaria ulna. The counting was performed 28 days after the heavy metal injection. (Type 1) : deformed valve outline; (Type 2) : defromed striations; (Type 3) : deformed longitudinal area; (Type 4) : mixed deformities (more than one type of deformity in the same frustules).

또한, 회귀분석 결과는 Cd, Cu, Fe 및 Zn이 규조종의 기형 발생의 원인임을 보여주었다. ^{McFarland et al. (1997)}과 ^{Morin et al. (2008)}은 Cd과 Zn 등의 중금속과 부착규조 형태 변이종 사이에 유의미한 양의 상관관계를 밝혔으며, 특히 Fragilaria ulna의 피각 (frustules)에서 비대칭적으로 구부러지거나 깊이 갈라진 valve (뚜껑)의 외형과 비정상적인 점무늬열 패턴, 변위 (displaced)된 세로축역 (longitudinal area)이 많이 보였다고 언급하였다. ^{Ruggiu et al. (1998)}은 이탈리아의 Orta 호수에서 1920년대 이래로 Cu가 호수에서 주요 독성 오염 물질로 인식되었으며, 이로 인해 부착규조의 종 조성 및 세포 체적 (biovolume)의 변화 외에도 Synedra tenera의 형태적 변이가 빈번히 발생하는 것으로 보고하였고, 그 유형으로는 valve (뚜껑)의 찌그러짐 등 비정상적인 외형을 언급하였다. 본 연구 결과 역시 위의 연구들과 유사한 결과를 보이는 것으로 나타났다.