2.2.1 P&R analyzer 장치구성 및 측정원리

본 연구에서는 C. vulgaris의 광합성량 및 호흡량을 측정하기 위하여, Fig. 1과 같이 자체적으로 P&R analyzer를 제작하여 사용하였다.

Fig. 1. Photosynthesis & Respiration (P&R) analyzer used in this study.

P&R analyzer는 본체 내부에 약 150 PPFD의 광을 조사하는 LED가 부착되어 있으며, 외부는 검은색 상자모양으로 암조건에서 외부의 빛을 차단하는 역할을 하였다. 본체 내부에 삽입되는 P&R 반응조는 Ø 90 mm × 93 mm (H)로 working volume은 430 ml였다. DO meter 본체는 미세조류의 광합성 및 호흡 과정에서 변화하는 DO를 실시간으로 기록하는 역할을 하였으며, DO meter에 연결된 전극을 시료에 직접 넣어 DO 변화를 측정하였다.

미세조류는 암조건에서 호흡을 수행하며 그 과정에서 수중의 산소를 소모하는 반면, 명조건에서는 호흡과 광합성을 동시에 수행하며 그 과정에서 대사산물로 산소를 생성하였다.

즉, 암조건에서는 시간이 지남에 따라 DO가 감소하게 되고, 명조건에서는 광합성으로 인해 생성된 산소와 호흡으로 소모된 산소의 차이에 해당하는 DO 변화가 일어나게 되었다. P&R analyzer를 운전할 때 암조건과 명조건의 측정시간을 15 min으로 동일하게 설정하였다. 암조건을 수행할 때는 광조사를 해주지 않았으며, 명조건을 수행할 때는 150 PPFD의 LED를 조사해 주었다.

본 연구에서는 암조건에서 변화한 DO량을 호흡량, 명조건에서 변화한 DO를 순광합성량으로 계산하였으며. 또한 암조건에서 변화한 DO와 명조건에서 변화한 DO의 합을 총광합성으로 계산하였다.

미세조류의 활성도에 따라 단위시간 동안 변화한 DO는 P&R analyzer를 이용하여 측정할 수 있었으며, 미세조류의 광합성 및 호흡 속도 산출이 가능하였다.

2.2.2 Chlorophyll-a 측정

광합성을 하는 모든 생물에 존재하는 Chl-a를 측정하기 위하여 수질오염공정시험법(^{ME, 2017})에 명시된 방법을 사용하였으며, 그 방법은 아래와 같다.

Chl-a를 측정하기 위해 채취한 미세조류 시료를 여지(GF/C)에 여과 후, 마쇄하였다. 그 후 아세톤(9+1)을 이용하여 마쇄한 내용물을 4°C 암조건에서 4 hr 이상 추출하였다. 추출한 시료를 원심분리기를 이용하여 20 min 이상 원심분리를 거쳐 분리하였다. 추출된 상등액을 분광광도계를 이용하여 750, 663, 645, 640 nm에서 측정하였다. 아래에 Chl-a를 산출하기 위한 산출식을 제시하였다.

X₁ : OD663 – OD750 X₂ : OD645 – OD750

X₃ : OD630 – OD750 OD : 흡광도 (optical density)

V₁ = 상층액의 양 (ml) V₂ = 여과한 시료의 양 (L)

위와 같은 방법으로 측정한 Chl-a 값은 C. vulgaris의 광합성 및 호흡 속도를 산출하기 위한 데이터로 사용되었다.

3.1.1 용존산소 포화도별 시료 준비

DO 포화도에 따른 광합성 및 호흡 속도 비교실험을 위해서 과포화 및 불포화 상태의 C. vulgaris 시료를 준비하였다. Autotrophic 조건에서 배양한 조류는 광합성 과정에서 산소를 생성하므로, sampling 직후의 DO는 약 10~15 mg-O₂/L로 과포화 상태이었다. 따라서, DO 과포화 시료는 별도의 탈기를 거치지 않고 sampling한 시료를 즉시 그대로 실험에 사용하였다.

한편, DO 불포화 시료는 sampling 직후에 과포화 상태인 시료에 질소탈기를 실시하여 DO 5 mg-O₂/L까지 탈기시켜 준비하였다. 불포화 시료의 DO 설정치를 5 mg-O₂/L로 정한 근거는 ^{Kim et al. (2012)}이 호기성 미생물은 DO가 최저 2 mg-O₂/L, 평균 4.5 mg-O₂/L 이상이 유지되어야 활성 관점에서 바람직하다고 보고한 내용이다. 더하여, 본 연구에서는 질소탈기 후 암조건을 적용했을 때 감소할 DO와 명조건을 적용했을 때 증가할 예상되는 DO 변화폭을 고려할 때, DO 불포화 시료는 5 mg-O₂/L 수준으로 유지하는 것이 적절하다고 판단하였다.

위와 같은 근거로 준비된 DO 과포화 및 불포화 시료에 대하여 자체 제작한 P&R analyzer를 이용하여, 암조건과 명조건에서 진행된 호흡 및 광합성 과정에서의 DO 변화 경향을 조사하였다.

3.1.2 시료의 용존산소 포화도가 P&R analyzer 측정치의 안정성에 미치는 영향

본 실험에서는 위 3.1.1에서 준비된 DO 과포화 및 불포화 시료를 대상으로 P&R analyzer를 이용하여, 광합성 및 호흡의 경향 및 효율에 어떠한 유의한 차이가 있는지 알아보았으며, DO 포화도에 따른 암조건과 명조건 구간에서의 DO 경향은 아래의 Fig. 2와 같았다.

Fig. 2. A comparison of respiration and net photosynthesis efficiency ofC. vulgarisaccording to the dissolved oxygen level.

Fig. 2를 보면, C. vulgaris의 호흡과정(Dark)에서는 15분 동안 DO 포화도에 따른 DO 변화량의 차이는 거의 없이 두 시료 모두 DO는 천천히 감소하였으나, 광합성 과정(Light)에서는 DO 포화도에 따른 DO 변화량의 차이가 컸다는 사실을 확인할 수 있었다. 순광합성 과정에서 DO 과포화 시료의 DO 변화는 4.5 mg-O₂/L, 불포화상태일 때의 변화량은 7.5 mg-O₂/L로, 동일한 미세조류 시료를 이용하여 즉시 실험하였음에도 불구하고, 초기 용존산소 포화도 차이에 따라, 약 1.7배의 순광합성 속도 차이를 보였다.

용존산소 포화도가 다른 두 시료에 대하여 P&R analyzer를 이용하여 30분 동안 진행하여 얻은 결과값들을 바탕으로, 총광합성량, 순광합성량 및 호흡량을 계산하여 비교한 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 두 시료 간의 총광합성량은 약 1.6배의 차이가 났고, 순광합성량은 전술한 바와 같이 약 1.7배의 차이를 보인 반면, 호흡량은 과포화상태에서는 0.6 mg-O₂/L, 불포화상태에서는 0.5 mg-O₂/L로 유의한 차이를 보이지 않았다.

Fig. 3. A comparison of the total photosynthesis, net photosynthesis, and respiration ofC. vulgarisaccording to the dissolved oxygen level.

위의 Fig. 2와 3의 명조건 결과와 같이, DO 과포화 시료에서의 광합성 효율이 DO 불포화 시료의 광합성 효율보다 낮은 원인으로, Fig. 4에 제시한 미세조류의 광호흡 기작을 들 수 있다. ^{Kazbar et al. (2019)}에 의하면, 광호흡(photorespiration)은 DO가 과포화 상태일 때 발생하는데, 광합성 과정에서 RuBisCO 효소가 이산화탄소를 고정시키는데 반해, 광호흡 과정에서는 RuBisCO 효소가 산소를 고정시킨다. 즉, DO 과포화 상태는 수중에 이산화탄소 보다 산소가 월등히 많은 상태이기 때문에, 산소를 리불로오스-1,5-이인산(RuBP)과 결합시키는 RuBisCO의 카르복실화/산소화 촉매기능이 촉진되어, RuBisCO 효소가 산소를 고정하는 비율이 높아진다. 결국, 이러한 기작들에 의해서 광합성보다 광호흡 기작이 우세해진다고 할 수 있다(^{Maurino and Peterhansel, 2010}).

Fig. 4. Photorespiration and photosynthesis mechanism of the microalgae (https://en.wikipedia.org/wiki/Photorespiration).

RuBP는 광합성 과정에서 카르복실화 반응에 의해 2분자의 3-포스포글리세르산(3-PGA)를 생성시키는 반면, 광호흡 과정에서는 산소화 반응을 통해 포스포글리콜산(2-phosphoglycolate, 2PG)을 생산한다(^{Peterhansel et al., 2013}). 3-PGA는 광합성에 바로 사용되지만, 광호흡 과정에서는 2PG가 3-PGA로 바뀌는 단계에서 ATP 손실이 일어나므로, 광합성 효율이 다소 낮아진다(^{Peterhansel et al., 2013}). 이상과 같은 설명들로부터, DO 과포화 시료에서 광호흡으로 인한 광합성 효율이 다소 감소하는 Fig. 2와 3의 실험결과가 설명된다.

3.1.3 용존산소 포화도에 따른 호흡 및 광합성 속도

용존산소 포화도가 호흡 및 광합성 속도에 미치는 영향을 Chl-a를 기준으로 평가하기 위하여, Fig. 2의 DO 변화량을 단위 Chl-a 당 광합성 및 호흡 속도로 표현하여 아래의 Fig. 5에 나타내고 용존산소 포화도의 영향을 비교 및 평가하였다.

Fig. 5. A comparison of the photosynthesis and respiration rate ofC. vulgarisaccording to the dissolved oxygen level

DO 과포화 상태에서의 광합성 속도는 776 µmol-O₂/mg-chl-a/h, DO 불포화 상태에서는 531 µmol-O₂/mg-chl-a/h로 각각 산출되어, 같은 광 조건임에도 불구하고 약 1.5배의 차이가 발생하였다.

이는 Fig. 4를 통해 설명했듯이, DO 과포화 조건에서 광합성 보다 광호흡이 우세하여 단위 Chl-a당 수행할 수 있는 광합성량에 저해를 받았음을 나타낸다. 이렇듯 DO 과포화 시료에 대한 호흡 및 광합성에 대한 실험 및 고찰 결과, DO 과포화 시료에서 광호흡에 기인한 저해가 확인된 바, 향후 본 연구에서 P&R analyzer를 이용하여 시료를 분석할 경우, DO 과포화 상태의 시료는 불포화 상태인 5 mg-O₂/L까지 탈기시킨 후 분석을 수행하는 것으로 결정하였다.

3.2.1 질소탈기 실험방법

용존산소 과포화 상태에서 광호흡에 의해 광합성 효율이 저해된다는 결과에 따라, DO 과포화 상태의 시료를 불포화 상태로 탈기시켜야 하는 필요성이 앞에서 검토된 바, 질소탈기시의 유량이 P&R analyzer 분석에 있어 DO 안정화에 미치는 영향을 알아보기 위해, 초기 DO 11~12 mg-O₂/L의 과포화 상태 시료를 대상으로 질소탈기 유량을 0.2, 0.5 및 1.0 L-N₂/min로 설정하여 DO가 5 mg-O₂/L가 될 때까지 탈기시킨 후, 이어 50분 동안 DO 안정화 경향을 모니터링하면서 DO 안정화 경향을 파악하였다. 또한, 탈기에 따른 DO 안정화 경향파악 실험 종료 후에는 DO 5 mg-O₂/L까지 질소탈기가 완료된 시점에서, 안정화 구간은 일단 10분, 암조건과 명조건은 기존에 P&R analyzer 분석에서 채택한 15분으로 각각 설정하여 표준적인 조건에서 호흡 및 광합성 속도를 측정하였다.

3.2.2 질소탈기 유량에 따른 DO 안정화

질소 탈기유량 0.2~1.0 L/min에 따른 DO 안정화 경향에 대한 실험결과는 Fig. 6과 같다. 초기 DO 11~12 mg-O₂/L의 과포화 상태 시료의 DO는 약 5분간 실시한 탈기에 의해 빠른 속도로 5 mg-O₂/L까지 감소했는데, 이후 5~50분 동안의 안정화 구간에서 탈기유량에 따라 다소 상이한 안정화 패턴을 보였다.

Fig. 6. DO stabilization patterns according to N2degassing flow rate (a) 0.2 L/min (b) 0.5 L/min, and (c) 1.0 L/min.

Fig. 6의 질소탈기 유량에 따른 안전화 경향을 보면, 0.5 및 1.0 L-N₂/min 유량에서 목표 DO인 5 mg-O₂/L 부근에서 두 유량 모두 안정적으로 서서히 감소하는 경향을 보였다. 그러나 1.0 L-N₂/min 조건은 탈기시 미세조류가 강한 난류에 의해 심각한 스트레스를 받을 우려가 있어, 본 연구에서는 탈기 효과가 거의 같으면서 탈기 강도가 50% 수준인 0.5 L-N₂/min을 DO 과포화 시료에 대한 질소탈기 유량으로 결정하였다.

한편 모든 질소탈기 유량 조건 결과에서, 안정화 구간 동안에 목표 탈기 농도선 근처에서 평행하게 안정화되지 않고 꾸준히 DO가 미량씩 감소하는 경향을 보였는데, 이는 해당 실험을 수행하는 동안 별도의 광을 조사하지 않고, 일상적인 실내의 형광등(5~10 PPFD) 하에서 진행되었기 때문이다. 즉, ^{Patel et al. (2019)}에 의하면, 미세조류의 광합성과 호흡량이 같아지는 광도를 광 보상점이라 하며, 광 보상점 이상의 광도가 주어져야 호흡에 의한 산소 소모량보다 광합성에 의한 산소 생산량이 높아지는데, 본 실험에서는 미세조류가 충분한 광합성을 수행할 수 있는 광량이 주어지지 않아 광합성량에 비해 호흡량이 약간 우세했기 때문에, 탈기 후에 DO가 평행하게 안정화되지 않고 천천히 감소하는 경향을 보이며 안정화되었다고 판단되었다.

그러나, P&R analyzer 분석시 암조건 구간에서는 빛을 조사해 주지 않아 광합성이 일어나지 않으며, 이어지는 명조건 구간에서는 광 보상점 이상의 광도 조건인 150 PPFD 수준의 광을 조사해 주기 때문에, 추후 P&R analyzer 분석 수행시 문제가 되지 않을 것으로 판단되었다. 결론적으로, P&R analyzer 실험결과를 바탕으로 적절한 질소탈기 유량에 대해 검토한 결과, 0.5 N₂-L/min 유량으로 질소탈기를 실시하는 것이 최적이라는 결과를 얻었다.

또한, DO 과포화 시료의 DO를 적정 수준인 5 mg-O₂/L로 조정하기 위해, 질소탈기를 0.5 N₂-L/min 유량으로 실시하면 시료의 DO 변화가 다소 불안정하여 안정화를 시켜줄 필요가 있다고 판단되었다. 이에, Fig. 7과 같이 12.5 mg-O₂/L 수준으로 과포화된 시료를 질소탈기를 통해 5 mg-O₂/L가 될 때까지 탈기 후, 안정화 구간을 15분으로 설정하여 정치해둔 상태에서 DO 변화를 모니터링하였다. 그 결과, 안정화 개시 5분 후부터 15분까지 상당히 안정된 DO를 유지하였다. 15분에 걸쳐 DO가 안정된 직후, P&R analyzer 분석을 수행하였다.

Fig. 7. Experimental P&R results to verify stabilization period.

암조건 구간(Dark period)에서의 DO 감소는 15분간 약 0.5 mg-O₂/L이었으며, 명조건 구간(Light period)에서의 DO 증가는 15분간 약 5.2 mg-O₂/L이었는데, DO 과포화 시료를 그대로 이용하여 P&R analyzer 분석을 수행할 경우 DO 변화가 축소되어 왜곡된 결과가 얻어지던 경우와 비교하면, 적절한 질소탈기에 의해 상당히 정확한 P&R analyzer 분석이 가능해졌다는 사실이 확인되었다.

3.3.1 OD 농도별 시료준비

시료의 OD 값이 P&R analyzer를 이용한 광합성 및 호흡량 분석에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 2.0 OD의 C. vulgaris를 이용하여 농축을 통해 2.25 OD, 2.5 OD, 3.0 OD의 시료를 준비하였다. C. vulgaris의 농축은 원심분리기를 이용할 경우 강한 원심력이 미세조류에게 스트레스로 작용할 우려가 있어, 3시간 이상 자연침강시킨 농축된 C. vulgaris를 이용하여 원하는 OD에 맞추어 조제하였다. 참고로 C. vulgaris는 침강성이 좋지 못해 단시간에 자연침강이 불가하여 3시간 이상 농축을 실시했다.

3.3.2 Self shading effect를 고려한 최대허용 OD 결정

미세조류의 활성도를 평가할 때 광합성 속도는 가장 중요한 평가인자 중 하나이므로 최대한 정확한 측정치를 얻는 것이 중요하다. 그런데, 미세조류는 OD가 커질수록 self shading effect에 의해 광량이 충분함에도 불구하고 광합성량이 광량에 비례하지 않는 등 실제 미세조류의 광합성 활성 보다 저평가를 받을 수 있다. Self shading effect는 Beer-Lambert Law의 원리와 일맥상통하며, 미세조류 광량에 따른 광합성 활성 실험에 있어 고려할 원리중 하나이다.

이에 P&R analyzer를 이용한 광합성 및 호흡량 분석에 있어, 시료의 OD 값이 광합성 및 호흡량 분석치에 미치는 부정적인 self shading effect 영향을 최소화하고자, P&R analyzer 분석시료의 최대허용 OD 값을 결정하기 위한 실험을 실시한 결과, Fig. 8과 같은 결과를 얻었다.

Fig. 8. A comparison of the total photosynthesis and respiration rate ofC. vulgarisaccording to several high OD values.

Fig. 8의 광합성 속도 결과를 보면, self shading effect의 영향을 받아 C. vulgaris의 OD가 높아질수록 광합성 속도는 점차 감소하는 경향을 보인 반면, 호흡속도 결과는 OD 농도에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다. 즉, 2.0 OD 조건에서 광합성 속도는 153 µmol-O₂/mg-chl-a/h 이었으나, 2.25 OD에서는 86 ㎛ol-O₂/㎎-Chl-a/hr, 3.0 OD에서는 84 ㎛ol-O₂/㎎-Chl- a/hr로 측정되어, 2.0 OD에 비해 3.0 OD에서 광합성 속도가 약 1.8배 저하된 결과를 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 바탕으로 본 연구에서는 추후 P&R analyzer 실험시, 2.0 OD를 초과하는 미세조류 시료의 경우, 전처리 개념으로 적절히 희석(본 연구에서는 1.0~1.5 OD 권장)을 실시한 후, P&R analyzer 실험을 하는 것이 적합하다는 판단을 하였다. 단, 당연하지만 미세조류 개체의 광합성 효율이 아닌, 채취한 미세조류 시료 자체로서의 광합성 및 호흡능역을 평가하는 경우라면 self shading effect를 포함한 값을 구해야하므로, 이러한 경우에는 희석을 실시할 필요 없이, 채취한 시료 그대로 P&R analyzer 분석에 이용하면 된다고 할 수 있다.