2.1 Fluorescence EEM with PARAFAC modeling

DOM 내 방향족 유기성분 중 일부는 형광특성을 가지고 있는데 이러한 성질을 이용한 형광특성 분석을 통해 DOM 농도 및 성상에 대한 실시간 모니터링이 가능하다. 단순 흡광분석의 경우 들어오는 빛에 대해 분산을 하여 각각의 파장에 대한 흡광도에 따라 2차원 정보를 얻을 수 있는데 반해 형광분석의 경우 들어오는 빛은 물론 그 형광을 받아 물질이 여기상태(excited state)에서 바닥상태(ground state)로 떨어질 때 나오는 장파장의 빛에 대해서 분광이 가능하다. 이러한 특징은 두 가지 파장을 적절히 조절하여 원하는 물질의 선택도(selectivity)를 높일 수 있을 뿐만 아니라 분석 감도(sensitivity)가 UV- VIS 분광광도계에 비해 10배 이상 높음으로서 0.1 mg C/L 이하의 저농도 DOM까지 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. DOM 분석 시 주로 사용하는 형광분석방법으로는 여기 및 방출 두 파장에 대해 전체를 스캔하여 3차원 정보를 얻을 수 있는 3차원 형광 EEM (excitation-emission matrix)이 있다. DOM 형광 분석은 수 분 내에 이루어지며 약 1 mL의 시료량만으로도 측정이 가능하기 때문에 실시간 모니터링 기법으로 활용할 수 있다. 그러나 2000년부터 본격적으로 사용된 일반적인 형광 모니터링 기술은 2010년 이후 환경 분야에서 이미 많이 보편화되었으며 파장에 따른 스펙트럼 정보를 단순히 “peak picking”으로 얻는 단순 기법(예: peak B, T, M, T, A) (^{Coble, 1996}) (Table 2)에 의존하여 세밀한 정보수집이 어려워 여러 피크들의 비율 등을 이용한 지표들(예: HIX, FI, BIX 등) (^{Huguet et al., 2009}; ^{Mcknight et al., 2001}; ^{Ohno, 2002}) (Table 3)이 제시되었으나 여전히 제한적이다. 특히 EEM 형광 피크 자체가 유사한 형광 특성을 가진 두 가지 이상의 DOM 구조의 부분 중복에서 나올 수 있을 가능성과 서로 다른 형광 특성을 가진 성분을 정량적으로 다루는데 한계가 많다는 점에서 형광 EEM 분석은 한계를 가지고 있다.

이러한 한계를 극복하고자 2003년 이후 형광 스펙트럼이 가지고 있는 수많은 성상 정보를 최대한 추출하기 위한 다양한 통계적 모델 적용이 시도되었다. 형광 스펙트럼은 이론적으로 비균질적인 혼합체인 DOM 내 존재하는 다양한 형광 유기성분이 중첩된 결과로서 인식되어 일부 시료에 대해 특정 유기 성분이 압도적일 경우 그 외 성분에 대해 평가절하될 수 있기 때문에 중첩된 스펙트럼 정보를 추출하기 위해 parallel factor analysis (PARAFAC)이 최근 유기물 형광 성분을 분리하여 정량화하는데 하나의 표준적인 방법으로서 제안되었다(^{Stedmon and Bro, 2008}; ^{Murphy et al., 2013}). 이 PARAFAC 모델 적용 시 실제로 사용해야 하는 시료 수에서 크게 제한받지 않으며(약 30개 이상) 유용한 스펙트럼 정보를 최대한으로 손쉽게 얻을 수 있다는 점에서 기존 DOM 형광 스펙트럼 분석을 발전할 수 있는 기술이라 할 수 있다. 그 결과 형광 EEM으로부터 3차원 스펙트럼 정보를 단백질계(protein-like), 펄빅산계(fulvic-like), 휴믹산계(humic-like) 등의 성분으로 나누어 추출하고 이를 정량화함으로써 스펙트럼 성분별 농도에 따른 적용이 가능하다. 피크의 위치나 단순 비율을 통한 평면적 분리에서 통계학적 모델링 기법을 기반으로 한 입체적 분리이기 때문에 중첩된 DOM 구조를 나누는 데 효과적이었다.

2.2 Molecular size distribution (SEC-OCD)

Size exclusion chromotography (SEC)는 DOM의 분자량 분포를 알 수 있는 크로마토그램 분석법이다. 이 분석법 역시 소량의 시료만을 사용하여 별도의 전처리 없이 30분 이내 측정이 가능하기 때문에 손쉽게 분자량 분포 정보를 알 수 있는 유용한 분석법이다. 기본적인 시스템은 일반 HPLC (high performance liquid chromatography)와 동일하지만 유기물 분자량 분획에 적합한 컬럼과 pH를 고정한 NaCl 버퍼 수용액을 이동상으로 사용한다는 점에서 일반적인 HPLC와 다르다고 볼 수 있다. 보편적으로 사용하는 컬럼은 단백질 구조가 충전된 Protein-PaK 컬럼이 있으며 이동상은 0.1M NaCl과 0.002M phosphate 수용액을 사용한다. 컬럼 내에서 분자량이 분획되는 기본 원리는 DOM 분자와 고정상 사이에 물리화학적 상호작용을 최소한 상태에서 고분자의 DOM은 먼저 컬럼을 통과하여 낮은 체류시간을 가지지만 저분자는 컬럼 내의 많은 공극과 접촉하여 나중에 컬럼을 나오게 되어 높은 체류 시간을 가지게 된다는 것이다(^{Her et al., 2002}).

감지기의 종류(UV 흡광도, 형광, NDIR 등)에 따라 분획되는 DOM의 정량화하는 대상이 달라지게 된다. 가장 흔하게 사용되는 UV흡광도의 경우 빛을 흡수하는 유기물 구조(주로 방향족 구조)만을 정량할 수 있는 반면에 SEC-OCD의 경우 그 검출기가 총 유기탄소 분석기(TOC analyzer)에 부착되어 있는 비분산 적외선 방식(Non-Dispersive Infrared Red, NDIR)으로 다양한 구조의 유기탄소에 대한 분자량 분포 자료를 획득할 수 있다. 그 결과 분자량 크기에 따라 총 5가지로 분획을 나뉠 수 있다(^{Huber et al., 2011}). 가장 큰 분자량을 지닌 고분자는 탄수화물, 단백질과 같은 생고분자 물질(Biopolymers, BP, > 20,000Da)로, 두 번째는 휴믹물질(Humic Substacnes, HS, ~1000Da), 다음은 휴믹물질의 기본 구조를 만드는 빌딩 블록(Building Blocks, BB, 200~500Da), 저분자성 유기산(Low Molecular Weight Acids, LMWA, <350Da), 저분자성 중성물질(Low Molecular Weight Neutrals, LMWN, <350Da)의 순서로 나타나며 크로마토그램에서 나온 정보를 통해 분자량 부분에 대한 개별 정량화가 가능하다.

2.3 Carbon/Nitrogen stable isotope ratio

탄소 안정동위원소는 대부분 ¹²C(98.9%)와 ¹³C(1.1%)의 형태로 존재하며, 화석(Belemnitella americana)내 탄산칼슘을 기준물로 하여 측정된다(^{Craig, 1957}). 자연계에서의 풍부한 함량 때문에 동위원소 조성의 변화도 크다. 생물 기원의 메탄으로부터 동물의 조직, 식물 등에 이르기까지 그 범위가 100‰까지 넓은 범위에 걸쳐 존재한다. 질소 안정동위원소는 대부분 ¹⁴N(99.6%)와 ¹⁵N(0.4%)의 형태로 존재하며, 가장 거대한 질소 저장고인 대기중 질소(N₂)를 이용하여 질소 안정동위원소비를 측정한다 (^{Mariotti, 1983}). 다양한 물질의 기원 및 환경 오염원을 추적하기 위한 지시자(indicator)로서 전 세계적으로 해양학, 생태학 및 환경학 분야에서 활발히 활용되고 있다. 자연유기물질의 거동은 일차적으로 이들의 기원에 따라 크게 달라질 수 있으며, 이를 파악하기 위해서 유기물 내 존재하는 탄소 및 질소 성분의 안정동위원소비(δ¹³C 및 δ¹⁵N)등이 기원 판별 지시자로서 유용하게 사용되었다(^{Costanzo et al., 2001}; ^{Lamb et al., 2006}; ^{Maberly et al., 1992}). 예를 들어, 육상과 해양에서 대기 중 이산화탄소로부터 광합성을 수행하는 식생(C3, δ¹³C; –27‰ 이하, δ¹⁵N; –5~–1‰) 및 해양조류(microalgae, δ¹³C; –22~–20‰, δ¹⁵N; 2~10‰)의 끝성분(end-member) 값의 범위는 분명한 차이를 나타내었다. 그러나 다소 많은 양의 물 시료에 대해서 동결건조 후 얻은 고형 시료에 대해서 무기탄소 제거 등과 같이 복잡한 전처리가 요구되므로, 입자성 시료에 비해 용존성 시료들에 대해서 어려움이 있다. 그 후 질량분석기(Isotope Ratio Mass spectroscopy: IRMS)를 이용하여 안정동위원소비가 측정된다. 좀더 자세히 설명하면, 대상 물질의 질량과 전하간의 비율(m/z)을 바탕으로 가스를 이온화하고 편자장내를 통과시켜 안정동위원소비를 측정하는 방식으로 전처리한 시료를 기기에 투입하면 가스 크로마토그램하여 화합물을 분리한 후 성분별 안정동위원소비 조성이 얻어진다(^{Dawson and Brook, 2001}).

2.4 Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectroscopy (FT-ICR-MS)

Ion cyclotron resonance (ICR)의 기본 원리는 자기장에서 이온의 주기적 원 운동은 그 질량에 반비례한다는 것이 기초를 두고 있으며 강한 자기장과 이를 포착하는 능력에 따라 질량에 대한 해상도가 커지게 된다. DOM 시료의 경우 분자 이온화시키는데 여러 이온화 방식 중 electrospray ionization (ESI) 방식이 DOM 분자에 대한 손상 없이 이온화 및 수증기화 할 수 있기 때문에 흔히 사용된다. FT-ICR-MS 분석 시 양이온과 음이온 모드가 있지만 일반적으로 DOM이 음이온을 띄는 경우가 많기 때문에 음이온 모드에서 설정하여 사용된다. 질량분석기 결과로부터 수백에서 수천 개의 피크와 이에 해당하는 유기물 분자에 대한 정보를 얻을 수 있지만 많은 정보를 한 번에 해석하기가 쉽지 않다. DOM 분석의 경우 가장 보편적으로 사용하는 그림이 H/C와 O/C의 비율을 이용한 van Krevelen diagram이다. 비록 분자량에 대한 정보를 얻을 수 있지만 C, H, O 등의 기본 원소비에 대한 분포를 알 수 있다. 이를 통해 lipids, carbohydrates, proteins, tannin, lignin, condensed hydrocarbon 등에 대한 정성적인 성분 정보를 알 수 있다(^{Minor et al., 2012}). 한편 FT-ICR-MS 음이온 모드 측정에서는 양이온 성분 등 시료 내 불순물에 의한 간섭효과가 크게 나타날 수 있으므로 대개 고상 추출법(Solid-phase extraction, SPE)을 통해 시료 내 불순물을 제거하는 동시에 농축시켜 메탄올에 녹여낸 후 측정한다(^{Dittmar et al., 2008}) (Fig. 2). 기존 DOM 연구에서 사용된 분광(예: UV-VIS 흡광도, 형광 EEM의 경우 시료 소모 없음) 혹은 크로마토그램류(예: SEC-OCD의 경우~1 mL) 분석법에 비해 다소 복잡하고 많은 양(1 L 이상)의 시료가 요구되며, 그와 동시에 고상에 일부 유기물이 고상에 흡착되지 않고 손실될 수 있으므로 제한적이다. 흔하게 SPE법에 쓰이는 카트리지 중 극성 매질이 충진되어 있는 Priority PolLutant-styrene divinyl benzene polymer 타입(PPL)을 이용한 추출법을 따르면 상대적으로 다른 카트리지(예: C18 타입의 카트리지의 경우 10% 미만)에 비해 높은 DOM 흡착률을 가지므로 가장 흔하게 사용된다. DOM 시료에 따라 10~60%의 유기물을 추출할 수 있으며, 기원에 따라 흡착률은 크게 상이할 수 있다(^{Chen et al., 2016}).

Fig. 2. Scheme for the isolation of SPE-DOM from the water sample (He et al., 2016).

3.1 Natural aquatic environments

조류 및 낙엽 추출 유기물과 유역 내 호수 및 하류 하천 DOM 시료를 대상으로 다른 SPE 전처리 방식(C-18 흡착제(소수성) vs. PPL 흡착제(친수성))의 시료에 대한 FT-ICR-MS 결과를 이용하여 자연유기물질 기원 및 생분해 양상에 대한 고찰되었다(^{Chen et al., 2016}). C18 흡착제는 일반적으로 낙엽 추출물을 제외하고 PPL 흡착제보다 더 다양한 분자식, 상대적으로 더 높은 분자량 및 더 다양한 비균질적 원자 DOM 화합물을 추출하는 것으로 밝혀졌다(Fig. 3). 또한, 동일한 SPE 방식에 대해 두 가지 끝성분 유기물 기원 시료는 Non- metric Multidimensional Scaling (NMDS) 분석결과에서 서로 반대되는 축 방향에 위치하여 동일한 SPE 전처리 방식도 유기물 기원에 따라 다른 성분 결과를 나타낼 수 있음을 시사하였다. 두 끝성분 유기물과 상류 호수 유기물 시료의 경우 단백질성, 타닌 계통, 그리고 이종 원자 DOM 성분이 많은 반면 이러한 성분은 하류로 갈수록 감소하는 점을 볼 때 자연적으로 쉽게 분해될 수 있는 성분임을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 3. Comparison of van Krevelen diagrams for DOM samples of various origins (Algae, Leaf, Lake, River) (Chen et al., 2016).

Fig. 4. NMDS analysis results for various molecular properties obtained from FT-ICR-MS (Chen et al., 2016).

국내 주요 하천(한강, 낙동강, 금강, 영산강) 퇴적물 내 공극수(pore water organic matter, PWOM)와 동일 퇴적물에 대한 alkaline extractable organic matter (AEOM)에 대한 EEM- PARAFAC 분석을 통해 서로 다른 특성 및 기원을 가지는 형광성분을 추출하고 이들 성분에 대한 퇴적물 표면과 공극수 사이의 거동 혹은 분배정도를 연구한 결과이다(^{He et al., 2016}). 총 31개의 퇴적물 시료에 대해 아래와 같이 4개의 형광성분들(Component 1: 단백질 유사(Tyrosine-like), C2: 단백질 유사(Trytophan-like), C3: 휴믹산 유사, C4: 육질성 휴믹산 유사 성분)이 성공적으로 추출되었으며 각 성분에 대한 설명을 아래에 표시하였다(Fig. 5). 각 시료마다 네 가지 다른 각 성분들의 최대 형광값이 정량화되었다. 예상과 같이 휴믹산계인 C3과 C4 상대적 성분 분포 및 휴믹화 정도를 나타내는 HIX에서 PWOM에 비해 퇴적물 AEOM에서 더 높게 나타나(C3(%): PWOM (10.1~44.2%) vs. AEOM (25.3~50.7%), C4 (%): PWOM (2.9~34.5%) vs. AEOM (9.2~36.8%), HIX: PWOM (0.18~5.58) vs. AEOM (1.62~14.50)) 상대적으로 소수성인 큰 고분자 구조의 휴믹 유사 DOM이 고체상보다는 용존상에 더 존재함을 확인할 수 있다(Fig. 6). 이것은 고분자 소수성 물질이 토양이나 퇴적물에 더 선택적으로 흡착된다는 기존 문헌결과와도 잘 일치한다. 각 성분 상대적 분포에서는 단백질 유사 형광 성분인 C1이 나머지 3개의 형광성분들과 달리 AEOM에 비해 압도적으로 PWOM에 더 존재하는 것으로 나타났으며(C1(%): PWOM (0.2~60.3%) vs. AEOM (0.0~17.0%)), C1의 경우 퇴적물과 공극수 유기물을 구분하는 지시자 역할을 할 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 형광분석을 통해 퇴적물-공극수 간 거동에 대한 환경적 영향은 다른 인자와의 관계 속에서 찾을 수 있는데 아래와 같이 다양한 인자(T-NH₄, H₂S, Al, Fe)와 연구에서 얻어진 형광 결과들을 대상으로 Spearman 상관분석을 실시한 결과 퇴적물 내 환원성 환경을 대표하는 황화수소와 생물학적 기원 DOM을 나타내는 BIX (Biological Index)와 유의미한 상관관계가 관찰되었으며(r=0.53, p<0.01), Non-metric multidimensional scaling (NMDS) 분석결과 상대적 단백질계 형광성분인 C1과 C2 분포가 황화수소 및 알루미늄 농도와 유사한 위치를 보이는바 (Fig. 7) 퇴적물에 대한 단백질 유사 성분의 존재는 알루미늄계 광물 분포와 퇴적물 내 환원 정도와 밀접한 관련이 있음을 시사한다.

Fig. 5. Four fluorescent components of sediment pore water and alkaline extracted organic matter from the sediment (C1: tyrosine-like, C2: tryptophan-like, C3: humic-like, C4: terrestrial humic-like components) (He et al., 2016).

Fig. 6. Box plots of PARAFAC components (a to d) and HIX (e) for both PWOM and AEOM from four major watersheds. Boxes indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers indicate the 5th and 95th percentiles, solid lines within boxes indicate the median values, and scatters indicate the outlier of samples (He et al., 2016).

Fig. 7. Non-metric multidimensional scaling (NMDS) of all relative ratios of spectral indicators (IndAEOM/IndPWOM) for the 26 selected sampling sites (a) and influencing factors fitted to the NMDS ordinates (b) (He et al., 2016).

3.2 Engineered treatment systems

응집-모래여과-오존-GAC흡착공정을 가진 국내 한 고도정수처리장 내 시료를 대상으로 SEC-OCD 분석을 실시한 후 각 공정에 따른 DOM의 분자량 성분 변화를 모니터링한 결과이다(^{Quang et al., 2015}). 정수 처리에서 응집은 고분자의 DOM 성분(BP)이 먼저 제거되고, 휴믹물질(HS)의 경우 독성인 염소소독부산물과 관련성이 크며, 저분자성 유기물(LMWA와 LMWN의 합)의 경우 처리 후 관망에서 미생물층을 형성하여 관망을 부식시킬 수 있는 등 DOM 분자량 정보는 정수처리 과정을 이해하고 공정을 최적화시키며 처리수의 향후 환경영향을 평가하는데 중요한 지표가 된다. 아래 그림은 유입수와 각 공정을 지난 후 DOM 분자량 분포를 비교한 것이다(Figs. 8 and 9). 결론적으로 BP와 HS 등 고분자 DOM 성분은 응집공정에서 선택적으로 제거됨을 관찰할 수 있었으며, GAC 흡착에 대해서는 저분자성 유기물이 더 많이 제거되었다. 또한 오존 공정 후에는 고분자성 물질이 저분자성 물질로 전환됨을 관찰할 수 있었다.

Fig. 8. Change in the SEC-OCD chromatogram with water treatment processes (Quang et al., 2015).

Fig. 9. Change in the five different MW fractions in each water treatment process (Quang et al., 2015).

안정동위원소 기법을 이용하여 생물학적 처리공정 내 Extracelluar Polymeric Substances (EPS) 및 바이오매스로의 기질 동화는 안정 동위원소를 통해 추적되었다(^{Arshad et al., 2021}). Soluble Microbial Products (SMP)와 EPS를 포함한 바이오매스에 대해서 탄소 함유 기질이 질소 화합물보다 더 빨리 동화되는 것으로 나타났으나, 새로운 미생물 부산물의 형성을 위한 기질 동화 속도는 탄소와 질소 모두 크게 다르지 않았다. SBR에서 EPS 및 바이오매스의 13C/12C 및 15N/14N 비율의 지속적인 증가는 SMP 동화의 분명한 증거로서 제공되었으며(Fig. 10), 활성 슬러지 미생물은 공급된 SMP의~11%만을 동화시키는 것으로 보이며, 대부분(~50%)은 처리되지 않은 상태로 남아있어 궁극적으로 유출 유기물 농도를 높이는데 기여할 수 있다. 따라서 탄소, 질소안정동위원소비를 이용하여 활성 슬러지 공정 내 EPS 형성에 대한 다양한 형태의 불안정성 및 SMP의 상대적 기여도를 추정되었다. 이는 추후에 슬러지 공정 내 유기 기질의 흐름 및 질량 균형을 설정하는데 도움을 줄 수 있으며 유해 오염원에 대한 추적의 목적으로도 이용될 수 있다.

Fig. 10. Variations in atom % values based on the13C/12C and15N/14N ratios during the operation. Isotope enrichment was calculated after considering the initial natural abundance of each element (Arshad et al., 2021).

3.3 Further applications

이렇듯, 수 환경 속 DOM을 자세히 이해하기 위해 도입된 최근 분석법들은 다양한 기원과 더불어 여러 환경/공학적 요인에 의해 변화하는 DOM의 특징을 밝혀내 여러 연구에 적용되고 있다. 그러나 자연 수 환경 속 DOM에 대한 초기 연구는 일부 기원의 DOM(예: 강, 낙엽, 토양 등)에 대한 특성화 및 생/광분해, 퇴적물 용출, 오염물 결합 등 단일 환경적 요인에 의한 변화에 주목하였으며, 수 처리 시스템 역시 개별 처리 공정 후 단순 변화 중심으로 기술되었다. 단일 요인에 의해 변화하는 DOM 관련 초기 연구에서 벗어나, 최근 연구에서는 실제 환경에서 발생될 다양한 환경적 요인 혹은 여러 기원의 DOM의 혼재를 모사하여 연구되고 있다. 예를 들어, 지정된 수계 내 강우에 의해 유입될 다양한 기원의 DOM 혼합을 가정하여 기원별 유기탄소 기여율을 산정하였다(^{Lee et al., 2019}) (Fig. 11). 즉, 같은 양의 유기물이 유입되더라도 수계 내 유의미한 영향을 끼칠 DOM에 대해서 조사하고자 하였다. 형광지표와 FT-ICR-MS를 기반으로 끝성분혼합분석(EMMA)을 이용하여 강우사상별(초기, 상승기, 정점, 하강기, 쇠퇴기) 수계 용존유기물 내 기원 유기물별 잠재적 기여도 변화를 조사하였으며, 특히 FT-ICR-MS를 이용한 강우 시료의 유기물 분석을 최초로 시도하였다. 강우 초기 때 수계 내 방류수의 기여율(~61%)이 가장 크게 나타났으며, 상승기에는 다양한 기원 유기물(방류수~20%, 표층토~13%, 지하수~14%)이 기여한 것으로 조사되었으며, 나머지 시기(정점, 하강기, 쇠퇴기)에서는 낙엽 및 갈대 (~28%)의 기여도가 중요한 부분을 차지하였다. 형광 지표를 이용한 기원 유기물의 기여율 예측 결과와 FT-ICR-MS 기반으로 한 분자 구조에 따른 결과는 대체로 일관된 경향을 보였다는 점도 주목할 만하다. 이렇듯, 수 환경 내 DOM이 가지는 환경적 중요도에 따라 추후 연구에서는 단순 특성화가 아닌 실제 환경 모사되어 고도 분석 연계를 통해 다양한 환경 현안문제 해결을 위한 새로운 방법론이 제시되기를 기대한다.

Fig. 11. Graphical abstract of the recent study using advanced DOM analytical techniques: Evaluation of the contribution of various types of organic matter flowing into the urban watershed during rainfall (Lee et al., 2019).