3.1.1 외부탄소원에 따른 연속회분식반응기 운영 효율

본 연구에서 외부탄소원에 따른 탈질성능을 평가하기 위해, 253일 동안 연속회분식반응기를 운영했다. 탈질속도의 향상을 위하여 유입 질산성 질소 농도를 100 mg-N/L에서 200 mg-N/L로 높이고, HRT를 2 day에서 0.5 day로 조절하였다. 그 결과, Phase Ⅰ에서 질산농도 초기 평균 109.61 ± 20.6 mg-N/L로 유입하여 안정화 기간을 거친 뒤 173.5 ± 3.6 mg-N/L로 유입 질산성질소를 높여주었다. 이에 부합하여 COD/NO₃^--N 비율을 5로 조절하기 위해 초기 COD 농도를 평균 520 ± 49 mg-COD/L로 투여하였고, 유입 질산성 질소 농도 증가 이후 COD 농도 또한 950.3 ± 250 mg-COD/L로 조절하였다. Phase Ⅰ에서 측정된 평균 COD/NO₃^--N 비율은 5.1 ± 1.2로 나타났다.

투입 바이오매스의 탈질공정 안정화 이후 유입질소부하속도는 0.087 ± 0.0018 kg-N/m³-day를 유지하였으며 총질소제거속도는 0.086 ± 0.0068 kg-N/m³-day를 나타냈고 유입되는 총질소가 99.62 ± 0.78%의 효율로 제거되는 것을 확인하였다 (Phase Ⅰ, day 21~35, Fig. 2). 이 값은 이전 연구인 ^{Park et al. (2020)}의 결과와 같이 메탄올을 외부탄소원으로 하는 초기 탈질반응에서 질소제거속도 0.1 kg-N/m³-day를 보였다.

Fig. 2. Influent nitrogen load rate, nitrogen removal rate, and nitrogen removal efficiency of the denitrifying sequencing batch reactor.

안정적인 초기 탈질반응을 달성한 후에, Phase Ⅱ-Ⅳ에서 HRT를 2 day에서 단계적으로 감소시켜 탈질반응의 고속화를 유도하고, 탈질성능을 평가했다. HRT를 1.75 day로 감소함에 따라 유입질소부하속도, 총질소제거속도, 총질소제거효율은 0.10 ± 0.0048 kg-N/m³-day, 0.099 ± 0.0088 kg-N/m³-day, 95.66 ± 4.63%를 각각 나타냈다(Phase Ⅱ). HRT를 1.5 day로 고속화하였을 때 유입질소부하속도 0.13 ± 0.0061 kg-N/m³-day를 유지하였으며 총질소제거속도 및 총질소제거율은 0.12 ± 0.0084 kg-N/m³-day와 92.47 ± 3.55%로 총질소제거율의 감소가 관찰되었다(Phase Ⅲ). 최종 HRT를 0.5 day로 감소한 Phase Ⅳ에는 유입질소부하속도, 총질소제거속도, 총질소제거효율이 0.41 ± 0.0020 kg-N/m³-day, 0.39 ± 0.025 kg-N/m³-day, 94.52 ± 3.07%로 나타났다. 해당 조건에서의 짧은 반응 시간으로 인해 탈질균이 충분한 탈질성능을 보이지 못했고 이는 반응기 내 질산성 질소의 축적으로 이어져 제거 성능의 한계가 발생하였다.

글루코오즈 및 아세트산에 독립적으로 적응시킨 두 가지 바이오매스와 Phase Ⅳ의 메탄올 적응 바이오매스를 혼합하였고, 외부탄소원은 메탄올로 고정하였다(Phase Ⅴ). HRT 0.5 day 조건에서 유입질소부하속도는 0.40 ± 0.015 kg-N/m³-day를 유지하였으며 총질소제거속도 및 총질소 제거율은 0.39 ± 0.016 kg-N/m³-day와 97.04 ± 3.74%로 효율이 상승되는 결과가 도출되었다. Phase Ⅵ에는 메탄올, 글루코오즈, 아세트산을 1:1:1 비율로 혼합한 주입한 결과, 유입질소부하속도, 총질소제거속도, 총질소제거효율은 0.43 ± 0.045 kg-N/m³-day, 0.42 ± 0.043 kg-N/m³-day, 98.22 ± 1.89%를 나타냈다. 이는 동일조건의 메탄올을 외부탄소원으로 이용하였을 때보다 총질소제거효율이 소폭 증가하였다.

외부탄소원 적용과 관련하여, 메탄올은 단순한 구조로 이루어져 탈질균이 외부탄소원으로 사용하기 용이하여, 다양한 폐수 처리에 효과적으로 적용되고 있다(^{Li et al., 2018}). 한편 글루코오즈와 아세트산과 같은 유기탄소를 메탄올과 혼합하여 탈질공정에 투여하여 다양한 탈질박테리아 군집을 유도한 연구사례도 있다. 메탄올과 아세트산을 혼합하여 이용한 경우, 메탄올 단일 외부탄소원에 비해 질산염 효율이 약 4배 높게 보고되었다(^{Hagman et al., 2008}). 이와 같이 혼합 외부탄소원을 이용한 탈질공정사례가 다양하게 보고되고 있다(He et al., 2018; ^{Jin et al., 2012}; ^{Ribera-Guardia et al., 2014}).

탈질운영에서 유입, 유출수의 질소조성 변화를 Fig. 3에 나타냈다. Phase Ⅰ의 탈질공정 안정화 기간 동안 유입질소농도는 143.11 ± 35.63 mg-N/L를 유지하여 투입되었고, 유출 암모니아성 및 아질산성 질소 농도는 4.31 ± 6.75 mg-N/L 및 1.40 ± 3.54 mg-N/L로 나타났고 질산성 질소는 전량 처리되었다. 흥미로운 점은 암모니아성 질소의 유입없이 질산성 질소만을 유입원수로 이용하였음에도 암모니아성 질소로 환원되고 있는 점인데 이는 본 연구의 탈질공정에서 NirBD 유전자를 가지고있는 Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium (DNRA)의 활성에 기인한 것으로 판단된다(^{Salah et al., 2019}). HRT를 1.75 day로 감소한 구간(Phase Ⅱ)에서는 유입질소농도가 182.50 ± 8.43 mg-N/L를 유지하였고 유출 암모니아성 질소는 1.15 ± 1.30 mg-N/L로 전 구간에 비해 감소한 반면 유출 아질산성질소는 6.53 ± 7.48 mg-N/L로 증가하는 경향을 나타냈다. Phase Ⅲ의 HRT 1.5 day 조건에서 유입 질산성 질소는 193.60 ± 8.93 mg-N/L이었으며, 질산성 질소는 전량 처리되었지만 유출 암모니아 농도는 1.44 ± 1.46 mg-N/L으로 유지되는 경향을 보였다. 유출 아질산성질소는 12.11 ± 6.08 mg-N/L로 약 2배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 최종 HRT를 0.5 day로 감소한 Phase Ⅳ에서는 유입질산성 농도가 204.09 ± 5.92 mg-N/L이었고, 유출 암모니아성 질소는 4.42 ± 2.05 mg-N/L로 Phase Ⅲ에 비해 다소 증가하였고 질산성 질소는 전량처리 되었다. 하지만 유출 아질산성 질소는 6.72 ± 5.69 mg-N/L로 나타났다. 아질산의 축적을 야기하는 불완전한 탈질의 원인은 전자공여체의 부족과 짧은 HRT로 예상된다. 전자공여체 부족 측면에서 Phase Ⅲ, Ⅳ에서 각각 유출되는 COD의 농도는 78.7 ± 96.8 mg-COD/L, 173.6 ± 86.6 mg-COD/L를 보였으므로 유기물의 부족은 아닌 것으로 확인이 되었다. Phase Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ 는 HRT를 감소시키는 단계로, 단축된 HRT는 탈질박테리아에게 충분한 반응시간을 제공하지 못하여 아질산 축적을 유발하였던 것으로 추측된다. 선행 연구에서도 바이오매스와 기질 사이의 접촉 시간을 충분히 제공하는 것이 중요한 인자로 보고하고 있고, 실패시 아질산의 축적을 보고하고 있다(^{Moussavi et al., 2015}; ^{Wang et al., 2009}). ^{Xiao et al. (2020)}은 단일 외부탄소원을 사용할 경우 나타나는 아질산성 질소 축적, 공정 불안정 안정성 등의 문제를 혼합 외부탄소원의 사용으로 극복할 수 있다고 설명했다. 특히, 잔존 아질산성 질소의 경우는 미생물에 독성을 일으킬 수 있으므로 관리가 필요하다(^{Zhou et al., 2011}).

Fig. 3. Changes in nitrogen composition of the influent and effluent.

Phase Ⅴ에서 글루코오즈 및 아세트산 외부탄소원 배양 균주를 이용하여 박테리아 군집을 다양화한 결과 유입 질산성 질소 농도 205.42 ± 10.95 mg-N/L 조건에서 유출 암모니아성 질소 및 아질산성 질소는 2.35 ± 1.53 mg-N/L 및 3.32 ± 7.43 mg-N/L으로 Phase Ⅰ-Ⅳ 구간에 비해 감소하는 경향을 나타냈다. 이는 혼합 외부탄소원 기반의 바이오매스 혼합만으로도 잔존 아질산성 질소의 저감이 가능함을 보여주고 있다. Phase Ⅵ의 혼합 외부탄소원의 주입 이후 유입 질신상 질소 농도는 209.40 ± 12.95 mg-N/L이었고, 질산성 질소는 전량 처리되었다. 유출 암모니아성 질소 및 아질산성질소 농도는 2.64 ± 2.81 mg-N/L 및 1.21 ± 3.56 mg-N/L으로 나타났다. 짧은 HRT 조건에서도 유출 암모니아와 아질산성 질소가 최소화되어 혼합 외부탄소원이 메탄올 단일 외부탄소원에 비해 장점을 가지는 것으로 판단된다.

3.1.2 C/N 비율에 따른 혼합 외부탄소원 탈질성능 평가

탈질공정에서 적절한 C/N 비율의 설정은 공정 성능에 영향을 주는 매우 중요한 인자이다(^{Anushya and Gupta, 2008}). 따라서, 혼합 외부탄소원의 COD/NO₃^--N 비율을 3.5, 5, 7.5로 설정해 탈질공정의 성능을 평가했다.

COD/NO₃^--N비율을 3.5로 설정할 경우, 유출수의 질산성 질소가 29.8 ± 14 mg-N/L로 나타났고 유출되는 COD는 측정한계 5 mg-COD/L 이하의 농도를 보여주었다. (Fig. 4). 이는 외부탄소원 부족으로 인해 탈질활성이 제한된 것을 나타내고 있다. NO₃^--N 비율 5와 7.5 조건의 경우 각각 127.7 ± 88.9 mg-COD/L, 492 ± 108 mg-COD/L의 COD가 잔류하는 것으로 나타나 충분한 외부탄소원이 공급된 것으로 판단된다. 혼합 외부탄소원을 이용한 탈질반응의 적정 C/N 비율을 Equation 8을 통해 도출했다. Fig. 5에 나타낸 소모 C/N 비율과 같이, COD/NO₃^--N 3.5, 5, 7.5 조건에서 각각 4.3 ± 0.4, 4.4 ± 0.8, 5.2 ± 0.7을 보였다. 이전 연구에서 메탄올 기반 탈질공정의 소모 C/N 비율은 반응기 형태, 원수 특성, 군집 구조의 차이에 따라 2.5-6.2로 나타났다(^{Park et al., 2020}; ^{Sujit et al., 2014}). 본 연구에서 소모 COD/NO₃^--N은 4.3-5.2의 범위를 보였고, 4-5 범위의 COD/NO₃^--N을 투여할 경우, 안정적인 탈질공정운영이 가능한 것으로 판단된다.

Fig. 4. Concentration distribution of (a) nitrate and (b) COD in the effluent of the denitrifying bioreactor according to the C/N ratio of mixed carbon sources.

Fig. 5. Consumption C/N ratio distribution according to the C/N ratio of mixed carbon sources.

3.3.1 외부탄소원에 따른 박테리아 군집 변화

외부탄소원이 변하는 조건에서 탈질기능을 수행하는 미생물을 판별하기 위하여, Phase Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ에서 미생물 시료를 샘플링하여 Illumina MiSeq 시퀸싱을 수행하였다. 105,260개의 정제된 박테리아 서열이 얻어졌으며, 943개의 박테리아 ASV로 할당되었다. Phase에서 높은 군집율을 가진 우점종 TOP 5를 Table 4에 나열하였고, 각 Phase별 군집구조는 Fig. 8과 같다.

Fig. 8. Microbial community structure in the denitrifying bioreactor according to the external carbon source.

탈질박테리아의 군집은 탈질반응기 운영 Phase에 따라 변화하였다. 운영기간 중 높은 우점도를 보인 탈질박테리아는 Methyloversatilis discipulorum, Azonexus hydrophilus, Haliscomenobacter hydrossis, Simplicispira psychrophila, Simplicispira hankyongi 그리고 Candidatus Saccharibacteria 으로 확인되었고, 메탄올을 이용하는 대표 탈질박테리아인 Hyphomicrobium sp. 는 1% 미만의 군집을 보였다. 그리고 탈질반응에 직접 관여하지 않지만 Acetobacterium wieringae 가 높은 우점도를 보여주었다.

메탄올을 외부탄소원으로 운영한 Phase Ⅳ에서 Methyloversatilis discipulorum는 43.84%의 높은 우점도를 나타냈다. 그러나 글루코오즈, 아세트산을 외부탄소원으로 배양된 탈질박테리아와 혼합하여 메탄올을 외부탄소원으로 운영한 탈질 Phase Ⅴ에서 우점도가 3.34%로 크게 감소하였고, 혼합 외부탄소원을 사용한 Phase Ⅵ에서는 0.36% 미만의 낮은 우점도를 보였다. 보고에 따르면 Methyloversatilis sp.는 메탄올 또는 메틸아민을 외부탄소원 및 에너지원으로 이용하는 Methylotroph인데, 메탄올을 산화시키는 Mdh-2, XoxF 그리고 MxaFI 유전자를 가지고 있어 메탄올과 같은 단일 탄소를 Serine cycle 또는 Calvin cycle을 통해 동화작용을 하고 탈질 및 질소 고정이 가능한 것으로 보고되고 있다(^{Kalyuzhnaya et al., 2008}; ^{Smalley et al., 2015}). 이전의 여러 연구에서도 25~37 ℃, pH 6.6~8에서 메탄올을 외부탄소원으로 사용하였을 때 Methyloversatilis sp.가 최적을 성장을 보였다(^{Baytshtok et al., 2009}; ^{Park et al., 2020}).

탈질기능을 가진 Azonexus hydrophilus는 Phase Ⅳ에서 10.49%로 두 번째 높은 우점도를 보였으나, Phase Ⅴ, Ⅵ에서는 군집율이 1% 미만으로 나타났다. Azonexus hydrophilus는 근권 토양에서 발견된 종속영양 탈질박테리아로써, 35~40 ℃, NaCl 0~1%, pH 7-8에서 최적의 생장을 보이는 것으로 알려져 있다(^{Reinhold-Hurek and Hurek, 2000}). 질소동화 유전자인 NifH, NifD, NifK를 가지고 있고, 질산염 환원효소인 NapAB, 산화질소를 분자 질소로 전환할 수 있는 NorBC, NosZ 유전자를 가지고 있어 탈질에 관여하는 것으로 보고 되고 있다(^{Salah et al., 2019}). 그리고 폐수처리장, 벼 토양과 같이 질소를 처리하거나 비료로 사용하는 환경에서 발견이 되고 있다(^{Park et al., 2016}; ^{Quan et al., 2006}).

Haliscomenobacter hydrossis는 Phase Ⅴ, Ⅵ에서 1% 이상의 우점도를 보인 박테리아로, 각각 12.80%, 6.15%의 우점도를 보였다. 26 ℃ 에서 최적을 성장을 보이며, 글루코오즈, 글루코사민, 유당, 자당 및 전분을 탄소 및 에너지원으로, 질산, 암모니아를 질소원으로 사용하는 것으로 알려져 있어 글루코오즈 섭취와 연관되어 있을 것으로 예상된다(^{Van Veen et al., 1973}). 또한 사상균으로써 활성슬러지에서 많이 발견되고 있고, 메탄올 공급 탈질반응에도 존재하는 것으로 보고되고 있어 혼합 외부탄소원에서 적응능력이 우수한 것으로 판단된다(^{Ginige et al., 2005}). Haliscomenobacter hydrossis는 슬러지 침강지수인 SVI와 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있는데, TN, 암모니아, Haliscomenobacter hydrossis의 증가에 따라 SVI 지수도 악화되는 경향을 보이고 있다(^{Cao and Lou, 2016}; ^{Van Veen et al., 1973}). 그러나 본 연구에서 해당 종은 슬러지 침강성에 큰 영향을 주지 못했는데, Haliscomenobacter hydrossis가 검출된 Phase Ⅴ, Ⅵ보다 검출되지 않은 Phase Ⅳ에서 SVI가 1.5배 악화가 되는 결과가 이를 증명한다. Candidatus Saccharibacteria는 우수한 침강성의 특징을 가지고 있는데(^{Zhang et al., 2022}), 해당 종이 우점한 Phase Ⅴ, Ⅵ 시기의 우수한 침강성에 긍정적인 영향을 준 것으로 판단된다.

Simplicispira sp.에 속하는 Simplicispira psychrophila, Simplicispira hankyongi는 Phase Ⅴ에서 각각 5.1%, 5.15%, Phase Ⅵ에서 4.11%, 3.82%의 우점도를 보이며 혼합 외부탄소원을 이용한 탈질반응에서 군집을 형성하는 박테리아로 보인다. Simplicispira sp.는 종종 산업폐수, 활성슬러지에서 발견되는 탈질박테리아로 보고되고 있다(^{Grabovich et al., 2006}). Simplicispira psychrophila는 산업폐수에서 분리되었으며 종속영양 박테리아로 통성혐기조건에서 탈질능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(^{Grabovich et al., 2006}). 미생물연료전지와 생물학적 질소 공정에서 주로 발견이 되고 있다(^{Liu et al., 2012}; ^{Zhu et al., 2017}). Simplicispira hankyongi 역시 폐수에서 분리한 탈질박테리아로 아세트산을 첨가한 배지에서 성장하였다(^{Siddiqi et al., 2020}).

Acetobacterium wieringae은 모든 Phase에서 1% 이상의 우점도를 보인 박테리아로 Phase Ⅳ에서 9.8% Phase Ⅴ에서 10.1%, Phase Ⅵ에서 2.4%를 보였다. 그람양성의 혐기성 독립영양생물로, H₂ 및 CO₂를 포함하는 무기질 배지에서 온도 30 ℃, pH 7.2~7.8에서 가장 잘 자라며, 4 moL의 수소와 2 moL의 이산화탄소가 1 moL의 아세트산으로 변환하는 아세트산 생성 박테리아로 보고되고 있다(^{Poehlein et al., 2016}). Acetobacterium sp.는 혐기성 소화공정에서 가장 많이 발견되고 있지만, 탈질공정에서도 꾸준히 발견되고 있다(^{Chen et al., 2017}).

Phase Ⅴ, Ⅵ에서 가장 높은 군집을 보인 박테리아 Candidatus Saccharibacteria는 각각 16.3%, 25.6%의 높은 군집을 보여, 본 미생물이 혼합 외부탄소원 주입조건에서 가장 주요한 탈질기능을 수행하는 박테리아로 사료된다.

3.3.2 혼합 외부탄소원의 C/N 비율에 따른 탈질박테리아 군집

본 연구에서는 혼합 외부탄소원 서로 다른 C/N 비율로 주입하였을 때 변화하는 박테리아 군집을 관찰하였다. 113,505개의 정제된 박테리아 서열이 얻어졌으며, 943개의 박테리아 ASV로 할당되었다. 각 C/N 비율별 우점종 TOP 5를 Table 5에 나열하였고, 군집구조는 Fig. 9에 나타내었다.

Fig. 9. Microbial community according to the C/N ratio using mixed carbon sources.

군집 분석결과, 세 반응기 모두 C/N 비율에 관계없이 Candidatus Saccharibacteria의 높은 우점도가 확인되었다. COD/NO₃^--N 3.5 5, 7.5에서 각각 51.48%, 60.35%, 60.48%로 우점했다. 해당 종은 토양, 활성슬러지, 수처리공장, 열대우림 토양, 스펀지, 대수층, 금광 그리고 호열성 지역과 같이 다양한 환경에서 확인이 되고 있지만 순수배양이 어렵다(^{Zielińska et al., 2016}). 그리고 최근 부분탈질(Partial Denitification, PD) 공정에서 발견되었는데, 전자공여체로 글루코오즈를 사용하는 탈질박테리아로 보고되고 있다(^{Xiujie et al., 2019}). 따라서 혼합 외부탄소원의 글루코오즈가 해당 종의 성장을 촉발한 것으로 예상된다. 또한 글리세롤을 외부탄소원으로 하는 PD 과정에서도 우수한 탈질성능과 침강성을 보여주는 것으로 보고되고 있으며(^{Zhang et al., 2022}), 본 연구에서도 216일에 44.9 mL/g의 SVI₃₀를 보이며 우수한 침강성을 보여주었다.

Mucilaginibacter limnophilus은 COD/NO₃^--N 3.5, 5에서 각각 5.31%, 2.07%로 우점도를 보였고, COD/NO₃^--N 7에서 발견되지 않아 고농도 혼합 외부탄소원을 두고 탈질박테리아가 경쟁하는 환경에서 생존하지 못한 것으로 판단된다. Mucilaginibacter limnophilus는 그람음성의 호기성, 비운동성의 막대균으로 온도 35~37 ℃, pH 6에서 최적의 성장을 가지는 종으로 알려져있고, 질산을 환원하는 기능은 없으나, 글루코오즈를 사용하는 것으로 보고되고 있다(^{Sheu et al., 2019}).

Hyphomicrobium nitrativorans도 COD/NO₃^--N이 3.5, 5에서만 군집을 형성한 박테리아로 각각 4.61%, 2.29%의 우점도를 보였다. Hyphomicrobium sp.는 메탄올을 공급하는 탈질공정에서 우점하는 Methylotrophs으로 잘 알려져 있고, 주변세포질에 질산염 환원 효소인 Nap, 막 결합 질산염 환원 효소인 Nar을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(^{Lu et al., 2014}). 또한 아질산염의 축적 없이 높은 질산염에서 완전한 탈질을 수행할 수 있는 박테리아로 보고되고 있다(^{Martineau et al., 2015}).