2.1 대상 미세조류 선정 및 배양

본 연구에 사용된 미세조류는 Korean Collection for Type Culture (KCTC)에서 분양받은 Arthrospira platensis 종을 사용하였고, 형태는 Fig. 1과 같다. A. platensis의 배양을 위해 사용한 배지는 SOT 배지이며, 구체적인 조성은 Table 1에 나타내었다. SOT 배지는 탄소, 질소, 인으로 구성된 SOT-1과 미량원소 및 마그네슘, 나트륨, 칼륨, 철 등으로 구성된 SOT-2로 이루어져 있다. 실험에 이용할 A. platensis의 생물량 확보를 위해, A. platensis를 SOT 배지에 접종한 후, 온도 25°C, 광도 100 PPFD의 환경이 조성된 광배양기(HB-305M, Hanbeak CO, KOREA)에서 계대배양이 진행되었다. 계대배양 후 보존 중인 A. platensis를 항온챔버 및 pH controller를 이용하여, 30°C, pH 9±0.5 및 200 PPFD 광도 조건에서 전배양을 진행하였다.

Fig. 1. Shape ofArthrospira platensis. (Nowicka-Krawczyk et al., 2019)

2.2 실험 조건 및 방법

pH에 따른 A. platensis의 무기탄소 섭취 및 TAG 축적에 미치는 영향을 파악하기 위해, 적정 pH 보다 낮은 pH와 적정 pH를 비교하고자 하였으며, 추가적으로 적정 pH 보다 높은 pH도 설정하였다. 따라서 pH 7, 9, 11에 대해 pH controller를 이용하여 ±0.5 이내로 0.1N H₂SO₄와 0.1N NaOH를 주입하면서 유지하도록 하였다. 본 실험에서 운전용량을 1.0 L로 하여, 9일간 실험을 진행하였으며, TAG 분석을 고려하여 초기 접종농도는 1.0 OD로 높게 설정하였다.

이때 사용된 배지는 SOT의 성상 중 탄소는 NaHCO₃ 200 mg-C/L, 질소는 NaNO₃ 32 mg-N/L, 인은 K₂HPO₄를 4 mg-P/L로 수정하여 주입해주었으며, 무기탄소, 질소 및 인은 fed batch type으로 고갈되지 않게 매일 추가 주입해주었다. 광도조건은 200 PPFD로 설정하였으며, 배양 온도는 30°C로 유지해주었다. 기타 세부사항 및 운전조건은 Table 2에 정리하여 나타내었다.

2.3 분석 방법

2.3.5 표준물질 및 검량선 작성

A. platensis의 TAG 함량을 측정하기 위해, 지질 표준물질인 triolein (Sigma-Aldrich Co., USA)을 스탠다드로 이용하였으며, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 µg/mL 농도의 triolein을 nile red로 염색하여 형광 강도를 측정하였다(Fig. 2). 이에 각 농도에 따른 형광 강도를 이용하여 검량선을 작성한 결과, 검량선의 상관계수(R²)는 0.9988로 높은 직선성을 보였으며, 이를 이용하여 A. platensis의 TAG 함량을 측정하였다.

Fig. 2. Fluorescence value by triolein concentration at excitation 470 nm.

3.1 A. platensis의 성장량

pH 7~11에 대하여 A. platensis의 성장에 미치는 영향을 측정하여 아래 Fig. 3에 나타내었다. 비성장속도 관점에서 pH 7이 0.01/day로 가장 낮았으며, pH 9는 0.07/day, pH 11은 0.03/day의 비성장속도를 보였다.

Fig. 3. Growth ofA. platensisaccording to pH.

비성장속도에서 관찰된 바와 같이, A. platensis가 성장하기에 적합한 pH 9 조건을 제외하고는, pH 7과 11에서 모두 pH 스트레스를 받은 것으로 보이나, pH 7에서 더 큰 스트레스를 받은 것으로 보인다.

이렇듯 적정 pH가 아닌 pH에서 성장이 저조한 이유로, 성장에 가용될 수 있는 에너지의 차이를 들 수 있다. ^{Ihnken et al., (2014)}에 따르면, 미세조류가 성장함에 있어 적합한 pH에서는 세포 내부 pH의 항상성을 유지하는데 소요되는 에너지는 거의 없다고 알려져 있다. 반면, 외부 pH가 적정 pH가 아닌 조건에서는 세포 내부의 pH를 적정한 pH로 유지하기 위하여 많은 양의 에너지를 소모하게 되고, 이로 인하여 실질적으로 세포합성에 사용되는 에너지가 낮기 때문에 미세조류의 성장과 대사과정에 저해를 줄 수 있다고 보고되고 있다(^{Sun et al., 2018}).

적정 pH가 아닌 pH에서 성장이 저조한 또 하나의 이유로, 광계를 구성하는 성분과 물의 광분해가 발생되는 망간 클러스터의 보호성분을 들 수 있다. 광합성이 일어나는 막인 틸라코이드 막에는 광계가 존재하는데, 광계는 복잡한 막단백질로써 적어도 20여개의 단백질, 엽록소, 카로테노이드 등으로 구성되어 있다(Arntzen et al., 1978, as cited in ^{Machold, 1981}).

또한, 광합성 대사 중 명반응은 광계Ⅱ에서 빛을 흡수하면 광계Ⅱ의 망간 클러스터에서 물의 광분해가 발생하고, 이때 생성된 전자가 광계를 거치면서 명반응이 시작되는데, 광계Ⅱ의 망간 클러스터는 많은 외인성 단백질에 의해 보호가 된다(^{Wollman et al., 1999}).

이처럼 광계의 구성성분과 물의 광분해가 발생되는 망간 클러스터의 보호 성분이 모두 단백질로 구성되어 있고, 단백질은 pH에 의해 쉽게 변성이 되는 성질에 의해, ^{Chorvatova (2020)}에서 보고한 바와 같이 pH 스트레스 조건에서는 외부 pH에 의해 광계의 변성과 광합성 전자 수송에 문제가 발생되어 광합성이 제대로 이루어지지 못해 성장에 저해를 받은 것으로 추측되었다.

3.2 pH 조건에 따른 무기탄소 소비량

A. platensis의 무기탄소 소비에 미치는 pH의 영향을 Fig. 4에 나타내었다. 본 연구에서는 A. platensis의 적정 pH 9에서 무기탄소의 섭취가 가장 높을 것으로 예상되었으나, pH 7에서 무기탄소의 소비가 비정상적으로 과도하게 섭취됨을 확인하였다. pH 7에서 무기탄소 소비가 가장 높았으며, 적정 pH 9 보다 1.6배, pH 11 보다 4.5배 가량 높은 소비량을 보였다.

Fig. 4. Cumulative consumption of inorganic carbon byA. platensisas a function of pH.

이렇듯 pH 7에서는 성장량에 비해 무기탄소 소비량이 높은데, 그 원인으로 A. platensis가 pH에 의해 스트레스를 받음에 따라, 세포 보호 메커니즘에 의해 TAG를 축적하는 특성을 지녔기 때문이라고 사료되었다(^{Lenka et al., 2016}).

미세조류는 성장에 적합한 환경 조건에선 세포막의 인지질과 당지질과 같은 세포 구조적으로 중요한 역할을 하는 극성 지질을 축적하지만(^{Satpati and Pal, 2015}), 외부 환경조건이 미세조류의 성장에 스트레스를 줄 때, 비극성 지질인 TAG를 축적한다고 알려져 있다(^{Illman et al., 2000}). 이에 TAG가 생성되는 메커니즘을 검토해본 결과(Fig. 5), TAG는 광합성 과정 중 캘빈 회로(Calvin cycle)의 대사산물과 유기적인 관계를 지니고 있다고 판단되었다.

Fig. 5. Mechanism of carbohydrate, protein and lipid metabolism in microalgae. (Ma et al., 2020)(Gray: carbohydrate biosynthetic pathway, blue: protein biosynthetic pathway, Purple: lipid biosynthesis pathway, orange: pigment biosynthesis pathway)

무기탄소가 유기화합물로 전환되는 과정인 캘빈 회로는 CO₂가 소비되면서 중간산물인3-phosphoglycerate (3-PGA)가 형성되는데, ^{Alishah Aratboni (2019)}에 따르면 3-PGA는 지질 생합성 과정에서 acetyl-CoA로 파생되고, 파생된 acetyl-CoA가 ACCase에 의해 malonyl-CoA로 변환되며 지질 대사에 이용된다고 보고되었다.

즉, 광합성 과정에서 CO₂가 소비되고, 캘빈 회로에서 생성되는 3-PGA로 인해, acetyle-CoA가 파생되며, acetyl-CoA가 malonyl-CoA로 변환됨으로써 TAG의 합성이 이루어지므로, pH 7에서의 높은 무기탄소 섭취는 TAG의 합성 및 축적과 관련이 있을 것이라 판단되었다. 이 부분을 규명하기 위해, 아래 3.3에서 pH에 따른 A. platensis의 TAG 함량변화를 분석 및 고찰하였다.

3.3 pH 조건에 따른 TAG 생성특성

9일에 걸친 pH 7~11에 대한 A. platensis의 TAG 함량분석 결과는 Fig. 6과 같다. TAG 분석을 통해 pH 조건 별 TAG 함량을 비교한 결과, pH 9와 pH 11은 TAG 함량에 유의한 차이를 보이지 않았으나, pH 7에서는 4일차 이후, pH 9와 pH 11에 비해 TAG 함량이 약 2배 높았다. 이는 앞서 언급한 바와 같이, A. platensis가 pH 스트레스에 의해 TAG를 축적하는 특성에 의한 결과라고 판단되었다.

Fig. 6. TAG content ofA. platensisaccording to pH.

성장량 및 기질 소비에서 검토된 바와 같이, A. platensis는 pH 11에서도 pH에 의한 스트레스를 받았으나, TAG 함량은 축적되지 않았다. 이는 TAG의 축적이 무기탄소 섭취와 관련성이 존재할 것으로 예상되어 Fig. 7에 A. platensis가 하루당 섭취한 무기탄소의 양을 제시하여 TAG의 축적과 미치는 영향을 파악하고자 하였다.

Fig. 7. Inorganic carbon consumption per day byA. platensisas a function of pH.

하루당 섭취한 무기탄소를 pH별로 비교하였을 때, pH 7은 120 mg-C/L/day, pH 9는 53 mg-C/L/day, pH 11은 23 mg-C/L/day씩 섭취함을 보였다. 무기탄소 섭취량과 TAG 함량을 비교해본 결과, TAG의 함량은 무기탄소 섭취와 비례하는 것을 볼 수 있었다. 따라서 무기탄소의 섭취량이 가장 많은 pH 7에서 TAG 함량 또한 높으며, 무기탄소 섭취량이 가장 적은 pH 11에서 TAG 함량이 가장 낮음을 보였다.

그러나 pH 9에서의 무기탄소 섭취량이 pH 11 보다 약 2배 높음에도 불구하고 TAG의 함량이 pH 11과 유의한 차이를 보이지 않은 이유로, A. platensis의 적정 pH에서 성장이 활발함에 따라 발생되는 대사적 특성 때문이라고 추측하였다.

pH 9에서 A. platensis는 높은 비성장 속도를 보이므로, 섭취한 무기탄소는 지질의 생성뿐만 아니라, 성장에 필요한 물질인 단백질, 탄수화물 등의 합성에도 사용되기 때문에, pH 9에서 섭취한 무기탄소의 양만큼 TAG의 함량이 증가하지 않았다고 추측하였다.

본 실험을 통해 A. platensis의 적정 pH 보다 낮은 pH에서 무기탄소 섭취가 비정상적으로 높았던 것은 스트레스 조건에서 세포를 보호하고자, TAG의 함량을 높였기 때문이라고 판단되었다. 즉, TAG의 합성은 미세조류가 섭취한 무기탄소 대사과정에서 생성되는 acetyl-CoA를 이용하는 특성을 바탕으로, A. platensis가 외부 pH에 의해 스트레스를 받음에 따라 TAG의 함량은 무기탄소의 섭취량과 비례하여 생성되는 경향을 볼 수 있었다.