2.2.1 남조류 세포수 검경

침강성이 좋지 않은 남조류는 현장에서 루골용액으로 고정한 후 희석하거나 일정량을 플랑크톤 넷트 또는 핸드 넷트로 걸러 일정 배율로 농축하여 시료로 하였으며, 현미경(Axio Imager A2, Carl Zeiss, Germany) 검경 배율 100배~1,000배 시야에서 세포의 형태와 내부구조 등의 미세한 사항을 관찰하면서 남조류의 종류를 조사하였다. 세포수 계수는 Sedwick-Rafter chamber에서 일정한 크기의 격자를 반복 계수하며 1 mL의 세포수를 산출하였으며, 군체를 형성하여 정확한 계수가 어려운 Microcystis 속은 1차로 동정 후 초음파 파쇄기(Sonics & Materials, Inc., US/VCX500)로 군체를 깬 다음 2차 계수를 실시하였다.

2.2.2 피코시아닌 분석

국내 공정시험기준 중 피코시아닌 농도 측정에 대해 규정된 시험법은 따로 없으며, 해외에서는 주로 ^{Sarada et al. (1999)}가 제시한 5가지 피코시아닌 색소 추출법에 기초하고 있는데, 5가지 추출 방법은 증류수를 이용한 자연 추출, 외력을 통한 세포벽 파쇄를 통한 추출, 동결⋅해동을 이용한 추출, 분쇄기기를 이용한 추출, 염산 등을 활용한 추출법으로 구분할 수 있다.

^{Ha et al. (2016)}의 국내 선행 연구에서 ^{Sarada et al. (1999)}의 동결 및 해동 방법을 바탕으로 피코시아닌 색소의 회수율을 높이기 위한 연구를 수행하였으며, 회수율을 비교하기 위해 여과지 사용 여부, 동결 및 해동 횟수, 초음파 파쇄 조건, 사전 균질화 시간 등의 조건을 이용하여 실험을 수행하였다. 본 연구에서는 ^{Ha et al. (2016)}의 피코시아닌 추출 방법을 이용하여 남조류 피코시아닌 농도를 분석하였다. 분석을 위해 농축한 시료 30 mL를 분취하여 50 mL 원심분리관에 담은 후, 200 W의 초음파를 이용하여 5초간 3회 파쇄하여 시료를 균질화하였다. 원심분리기를 이용하여 5°C 로 유지한 후 4,000 rpm의 속도로 15분간 원심 분리 후, 상등액을 제거하고 phosphate buffer (pH 7.2) 용액 5 mL를 넣은 후 – 20°C에서 24시간 동결하였다. 시료는 상온에서 자연해동을 하였으며, 색소가 buffer 용액에 잘 스며 나오도록 진탕배양기를 이용하여 37°C 환경에서 15분간 교반하였다. 이후 동일한 조건으로 2차 원심분리 과정을 통해 색소가 추출된 시료의 상등액을 적당량 분취하여 분광광도계(SHIMADZU, UV-2450)를 이용하여 620 nm와 652 nm 파장의 흡광도를 측정하였으며, ^{Bennett and Bogorad (1973)}가 제안한 식 (1)에 적용하여 농도 값을 계산하고, 현장 시료 농축 배수를 고려하여 최종 농도값을 도출하였다.

OD_λ = λ 파장에서의 흡광도(Optical Density)

V₁ =상층액의 양(mL)

V₂ = 여과한 시료의 양(L)

2.2.3 실시간 피코시아닌 모니터링

일반적으로 식물 플랑크톤의 현존량을 평가하는 기법에는 모든 식물 플랑크톤이 클로로필 a를 갖고 있으므로 이를 정량화하여 현존량을 추정하는 기법을 가장 보편적으로 사용하고 있다(^{Lorenzen, 1967}; ^{Richards and Thompson, 1952}). 엽록소는 엽록체 내의 틸라코이드막에서 단백질과 비공유결합 상태로 존재하며, 이를 엽록소-단백질 복합체(chlorophyll-protein complex, CP복합체)라고 한다. 광의 흡수에 의해 여기상태에 있는 CP 복합체의 엽록소 분자의 에너지는 일부가 광합성에 이용되고 나머지는 형광, 인광 또는 열로 방출되고 기저상태로 된다. 이 때 형광의 주요원은 pigment-protein complex로서 주로 제2광계에서 방출되며, 이러한 원리를 이용하여 형광스펙트럼을 분석함으로써 식물 플랑크톤의 광합성활성에 대한 많은 정보를 얻을 수 있다(^{Eullaffroy and Vernet, 2003}; ^{Lichtenthaler, 1988}).

남조류의 경우 엽록소 a 이외에 보조 색소인 Phycocyanin과 Phycoerythrocyanin이 특이적으로 존재하여 이들 색소를 분석함으로서 남조류의 정량 및 정성 분석에 활용되어 왔다(^{ME, 2010}).

피코시아닌은 남조류 고유의 보조 광합성 색소로 피코시아닌 형광은 고유의 여기 및 방출 파장을 가지고 있다(^{Rousso et al., 2022}). 현장에서 형광측정센서를 이용하여 남조류에 청색 파장의 빛을 조사하면 일부를 흡수하고 적색 파장의 빛을 방출하게 되는데 남조류가 많을수록 더 많은 적색 파장의 빛이 생성되므로 이를 이용하여 남조류의 양을 측정할 수 있는 기법으로, excitation (590 nm), emission (≥ 645 nm) 파장의 형광측정장치(Cyclops-7, Turner Designs, USA)를 이용하여 측정하고 있으며, 표층에서 수심 10 m 지점까지 센서가 이동하며 측정된 자료를 사용하였다. 측정 센서는 낙동강 하굿둑 상류 12 km 구포대교(P19)에 설치되어 있으며, 피코시아닌 이외에 염분, 전도도, DO, pH, 수온도 함께 실시간 모니터링 데이터를 수집하고 있다(Fig. 2).

Fig. 2. Location of in-situ cyanobacterial fluorescence sensor.

수집된 데이터 중 남조류 세포수가 조류경보제 친수활동 구간 관심 단계(2회 연속 채취 시 남조류 세포수 20,000 cells/mL 이상, 100,000 cells/mL 미만)를 초과하는 7월에서 8월 중 수심별 평균자료를 이용하였으며, 결측일이 포함된 기간은 제외하였다.

3.3.1 유해 남조류 발생 및 수질 인자

낙동강 하류 친수활동 구간 화명생태공원과 삼락생태공원 및 실시간 피코시아닌 모니터링 시스템이 설치된 구포대교 지점에 대해 하절기(7월~9월) 주 1회 유해 남조류 4속(Anabaena 속, Aphanizomenon 속, Microcystis 속, Oscillatoria 속) 세포수 및 수질 모니터링을 실시하였다. 유해 남조류 세포수 분포는 화명생태공원(276~662,103) cells/mL, 삼락생태공원(241~155,812) cells/mL, 구포대교(99~239,072) cells/mL로 나타났으며, 세 지점 모두 Microcystis 속이 전체 유해 남조류 중 99%를 차지하는 것으로 나타났다. 친수활동 구간의 조류경보제 발령단계 관심 수준에 해당하는 20,000 cells/mL 이상의 세포수는 세 지점 모두 7월 6일에서 8월 9일까지 지속된 것으로 나타났으며, 8월 10일 이후 중부지방 집중 호우에 따른 보와 하굿둑 개방으로 본류 내 세포수가 감소한 것으로 나타났다(Fig. 6).

Fig. 6. Temporal variations of four-genera of harmful cyanobacteria (cells/mL). (a) Hwamyung Ecological Park, (b) Samrak Ecological Park, (c) Gupodaegyo.

전체 조류 현존량을 나타내는 클로로필 a의 농도 분포는 화명생태공원 (6.3~144.3) mg/m³, 삼락생태공원 (5.8~70.2) mg/m³, 구포대교 (7.9~100.6) mg/m³의 분포를 보였고, 남조류의 보조 색소로서 남조류 고유의 남색을 띄게 하는 피코시아닌의 농도는 화명생태공원(0.01~2.94) mg/m³, 삼락생태공원(0.01~0.85) mg/m³, 구포대교(0.02~0.96) mg/m³ 의 분포를 보였다.

지점별 유해 남조류 세포수와 조류 현존량 지표인 클로로필 a과 피코시아닌 농도 분포는 화명생태공원이 가장 높은 것으로 나타났으며, 하류 방향인 삼락생태공원이 낮은 것으로 나타났다. 가장 많은 세포수가 조사된 날은 화명(8.4, 662,103 cells/mL), 삼락(7.13, 155,812 cells/mL), 구포(7.20, 239,072 cells/mL)로 지점별로 일치하지 않는 것으로 나타났다(Table 2, Fig. 7).

Fig. 7. Temporal variations of (a) Chlorophylla, (b) Phycocyanin.

3.3.2 유해 남조류 발생량과 피코시아닌 및 수질 인자의 상관분석

유해 남조류 4속의 세포수와 남조류 보조색소인 피코시아닌 및 주요 수질 인자와의 상관관계 분석을 실시하였다. 분석은 수질 자료가 정규분포를 나타내지 않아 비모수 상관분석에 의한 Spearman correlation coefficient를 산출하였다. 분석 결과, 유의수준 p-value < 0.001 에서 유해 남조류 세포수는 우점종인 Microcystis 속, 피코시아닌 농도, 수온 및 pH 와 상관성이 높은 것으로 나타났고, 클로로필 a 농도는 피코시아닌에 비해 상관성이 낮은 것으로 나타났다(Fig. 8, Table 3, Table 4).

Fig. 8. Correlation coefficient between water quality factors and cyanobacterial cell density in the study area.

클로로필 a, 피코시아닌 농도와 유해 남조류 세포수의 단순회귀 분석 결과, 결정계수(r²)는 클로로필 a가 0.3683 피코시아닌이 0.8455로 나타났고 세포수가 증가함에 따라 클로로필 a의 오차 범위가 피코시아닌보다 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 9). 또한 계절적으로 규조류가 우점을 보였던 1월~3월의 클로로필 a 농도가 전체 식물 플랑크톤 세포수가 증가하는 4월~6월 보다 높게 나타난 것으로 볼 때 남조류를 모니터링하기 위해서는 전체 조류 현존량 지표인 클로로필 a 보다는 피코시아닌이 더 유용한 지표라 사료된다(Fig. 4, Fig. 5).

Fig. 9. Relationship between cyanobacterial cell density and (a) Phycocyanin, (b) Chlorophylla.

피코시아닌 추출법 결과와 세포수를 바탕으로 산출한 상관식에 친수활동구간 관심, 경계 경보기준인 20,000 cells/mL, 100,000 cells/mL의 피코시아닌 농도 값을 산출 한 결과 각각 0.128 mg/m³, 0.444 mg/m³ 으로 나타났다. 조사기간 중 세포수 20,000 cells/mL 이상을 보인 지점 중 피코시아닌 농도 값이 0.128 mg/m³ 이상으로 나타난 경우가 94.4%, 세포수 100,000 cells/mL 이상을 나타내면서 피코시아닌 농도 값이 0.444 mg/m³ 이상으로 나타난 경우가 57.1% 로 관심 단계 수준에서 세포수와 피코시아닌 농도 간에 좀 더 유의미한 결과를 도출할 수 있었으며, 이는 집락을 형성하는 Microcystis 속 등 남조류의 발생 정도가 심할 때 세포의 다양한 크기와 형태에 따라 피코시아닌 함량이 달라질 수 있기 때문이라 판단된다.

3.4.1 시계열 변동 특성

7월 26일에서 8월 16일까지의 실시간 피코시아닌의 시계열 변동 특성을 일평균자료를 이용하여 수심별로 나타내었다. 조류경보 관심단계 20,000 cells/mL에 해당하는 피코시아닌 측정값(0.106 RFU)은 유량 변동이 크지 않은 기간 동안 수심 6 m까지 관찰되었으며, 7월 28일 유량이 전일과 비교해 65% 감소하면서 최저층에서도 비교적 높은 농도를 보였다(Fig. 11). 8월 10일 이후 중부지방 집중호우로 본류 유량이 증가한 것을 전후해 상류에서 내려온 녹조로 최고 농도를 보였으며 (8월10일 표층 0.74 RFU, 저층 0.19 RFU) 이후 감소하여 전 수심에 걸쳐 감소한 것으로 나타났다(Fig. 12). 대청호에서 수행한 식물 플랑크톤 수직 분포에 대한 선행 연구에서 하절기 표층에서 수심 6 m까지 누적 현존량이 전체의 94.9%였으며, Microcystis 속이 수심별 93.4~99.3%를 차지하는 것으로 볼 때(^{Park et al., 2006}), 낙동강 하류도 유량 안정기 비교적 저층까지 Microcystis 속이 분포 가능성을 나타내었다.

Fig. 11. Time-series variation of rainfall, flow and phycocyanin_ online(RFU) (Gupodaegyo, 7.26~8.16).

Fig. 12. Diurnal variations in flow.

3.4.2 일주기 변동 특성

일주기 변동 특성을 파악하기 위해 중부지방 집중호우로 유량이 증가한 시점을 전후(7.26~8.9, 8.10~8.16)로 각각 모니터링된 전체 데이터를 수심에 따라 시간대 별로 정리한 다음, 해당 시간대의 평균을 산출하여 24시간 변동 특성을 나타내었다. 일 유량변화는 유량증가 시점을 전후해 시간별 편차가 심한 것으로 나타났고(Fig. 12), 피코시아닌 농도 분포는 유량 안정기에는 수심별로 교란이 일어나지 않았으며 개방 후에는 수심 4 m~5 m 정도까지 교란이 일어나는 것으로 나타났다(Fig. 13).

Fig. 13. Diurnal variations in phycocyanin concentration. (a) Before increasing the flow rate, (b) After increasing the flow rate.

수문 개방 전 피코시아닌의 시간대별 표층의 평균 농도 분포가 개방 후에 비해 시간대에 따라 변동하는 것으로 나타났는데, 가장 높은 농도 분포는 새벽 3시경으로 증가했다가 급감하는 패턴 보였고, 이후 일사량이 증가함에 따라 10시 경부터 증가하여 일정 수준으로 유지되다가 오후 5시 이후 감소하는 것으로 나타났다. 이는 자연수에서 Microcystis 속의 최대성장률(Maximum growth rate, μ_max)이 2.1~4.4로 변이 폭이 매우 크게 나타나나(^{Hammer, 1964}; ^{Reynolds, 1973}; ^{Reynolds and Walsby, 1975}), 일반적으로 광합성에 의해 영양분이 세포 내에 축적되면 팽압(Turgor pressure)으로 기낭이 파괴되어 침강하고, 영양분이 모두 소모되면 팽압이 사라져 다시 기낭을 형성하여 수표면으로 다시 상승하게 되는데(^{Horne and Goldman. 1994}), 이러한 영향으로 새벽 표층에 농도가 높아진 것으로 사료된다.