2.1.1 알지네이트 겔 내부 내생포자 생존성 검증

내생포자를 확보하기 위해 이 연구에 사용할 균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 DSM(내생포자 형성 배지, difo sporulation media Table 1)에 30℃ 조건에서 48시간 동안 배양하였고, 영양세포를 사멸시키기 위해 lysozyme처리 및 열처리(70℃, 30min)를 진행하였다. 그 후 원심분리를 하여 배지 성분과 포자를 분리하고 1XPBS buffer(완충용액, pH 7.4)에 3회 이상 세척하여 순도 높은 내생포자를 확보했다^{(Lee et al., 2023)}.

내생포자가 첨가된 알지네이트 겔을 Drop point 방법으로 만들었고, 겔 내부에서의 존재 여부를 파악하기 위해 위상차 현미경을 이용하여 Fig. 1에 보이는 바와 같이 1000배율에서 내부를 관찰하였다. 생존 여부를 검증하기 위해 알지네이트 겔을 Fig. 2와 같이 고체배지 중앙에 접종하였고, 30℃에서 24시간 동안 배양하여 균주의 성장을 관찰하였다.

Fig. 1와 같이, 위상차 현미경 관찰을 통해 알지네이트 겔 내부 내생포자의 존재를 확인하였으며, 배양 시 알지네이트 겔 중심으로부터 박테리아 콜로니가 형성되었다. 이 콜로니 샘플을 16S rRNA 염기서열기반으로 동정한 결과 바실러스 서브틸리스임을 확인되었으므로 초기에 접종한 균주가 겔 내부에서 생존하여 있음이 검증되었다.

Fig. 1 Inside of alginate gel

Fig. 2 Colony of Bacillus subtilis

2.1.2 균열치유제 제조방법에 따른 치유제 성능 분석

박테리아가 적용된 균열치유제의 제조방법에 따른 콘크리트의 균열치유성능에 대한 영향을 분석하기 위해 콘크리트 혼입 방식과 알지네이트 겔의 건조 방식에 대한 비교실험을 수행하였다. Table 2와 같은 조성으로 탄산칼슘 형성에 필요한 성분과 내생포자를 알지네이트 겔로 제작 후, 동결건조 또는 건열건조 방식으로 제조된 두 가지 분말 형태의 균열치유제와 앞 절에 기술한 바와 같은 방법으로 포자를 확보하였다. 1XPBS buffer(pH 7.4)에 희석하여 농도를 맞춘 액상형의 포자현탁액(spore suspension) 총 세 가지 실험군을 통해 콘크리트 균열치유성능에 대한 비교실험을 진행하였다. 포자를 이용하여 제작된 알지네이트 겔은 Fig. 3과 같이 1mm 안팎으로 건조 방법에 따라 입자의 크기 차이가 다소 존재하였고, 포자현탁액의 형태는 Fig. 4와 같다.

세 가지 제조방식의 균열치유제는 50x50x50mm 정육면체 모르타르에 첨가하여 인위적으로 균열을 생성한 후 균열치유현상을 모니터링하였다. 모르타르의 물:시멘트:모래 비율은 1:2:4 비율로 제작하였고, 세 종류의 모르타르 모두 단위체적 1cm3 당 포자의 개수를 107개로 동등하게 첨가하였다.^{(Xu et al., 2014; Chahal et al., 2011)} 액상형인 포자현탁액을 적용하는 모르타르는 배합수에 탄산칼슘 형성을 위한 필수요소를 용해 시켜 콘크리트에 첨가하였다. 액상형 및 분말형 균열치유제의 각 모르타르 조성비율은 Table 3에 보이는 바와 같다.

균열치유제 내부의 미생물이 몰드(mold) 틈새로 간섭할 수 있으므로 유형별 치유제가 첨가된 모르타르들은 Fig. 5와 같이 각각 분리된 몰드에 타설하였고, 7일 경과 후 몰드에서 탈거하였다. 균열유발 시점에 따라 두 가지 그룹 A와 B로 분류하였으며, 그룹 A 모르타르는 탈거 직후(타설 후 7일이 경과된 시점) 바로 인위적 하중을 재하하여 균열을 발생시켰고, 그룹 B 모르타르는 타설 후 28일이 경과된 시점에서 인위적 균열을 발생시켰다. 그룹 A, 그룹 B 모두 균열현미경을 통하여 50배율로 24시간 간격으로 균열 치유현상을 모니터링하였다. 두 개 그룹에 대하여 각각 균열 발생 후 72시간이 되는 시점에서 Fig. 6과 Fig. 7의 건열건조 겔과 포자현탁액을 첨가한 모르타르 균열(A-f, A-h, B-f, B-h)에서는 치유현상이 관찰되었다. 반면에 일반 모르타르와 동결건조 겔이 첨가된 모르타르 균열(A-b, A-d, B-b, B-d)에서는 치유현상이 발생하지 않았다. 동결 건조 시 세포 동결 보존제의 부재로 얼음 결정으로 인해 세포 손상이 발생하였고, 대부분의 미생물이 사멸하여 치유제의 균열치유능력이 손실된 것으로 사료된다.

건열건조 알지네이트 겔과 포자현탁액을 첨가한 모르타르의 경우 균열발생 후 72시간 내 균열치유현상이 어느정도 확인되었으나, 동결건조 알지네이트 겔의 경우에 어떠한 균열치유현상도 발견되지 않았다.

Fig. 3 Freeze-drying(R), Heat-drying(L)

Fig. 4 Spore suspension

Fig. 5 Mortar in mold

Fig. 6 [Group A] a, b plain mortar/ c, d freeze-drying gel mortar/ e, f heat-drying gel mortar/ g, h spore suspension mortar (before self-healing a, c, e, g / after self-healing b,d,f,h)

Fig. 7 [Group B] a, b plain mortar/ c, d freeze-drying gel mortar/ e, f heat-drying gel mortar/ g, h spore suspension mortar (before self-healing a, c, e, g / after self-healing b, d, f, h)

2.2.1 실 구조물 적용 균열치유제의 균열치유성능 분석

2.1절에서 콘크리트 균열치유성능이 상대적으로 뛰어났던 건열건조방식으로 제조된 알지네이트 겔 균열치유제를 대상으로 실 구조물 스케일의 실증실험을 진행하였다. 균열치유제를 혼화제 형태로 콘크리트 배합 시 첨가하여 Fig. 8과 같이 박스형 암거 형태의 실증시험체를 타설하였고, 중앙에 격벽을 설치하여 이 벽을 기준으로 우측 암거 a와 c는 일반 콘크리트로, 좌측 암거 b와 d는 균열치유제를 첨가한 콘크리트로 타설을 진행하였다. 콘크리트의 균열발생과 발생한 균열의 자발적 균열치유현상을 모니터링하였다.

실증시험체 타설 후 2주 경과 시점에서 a, b 암거의 상부 슬래브 하단 면에서 관통 균열이 발견되었고, 각 a와 b의 균열 부위 중 세 곳을 무작위로 선정하여 Fig. 9와 Fig. 10에 나타낸 바와 같이 24시간 간격으로 균열 현미경으로 균열부를 관찰하였다. 콘크리트의 균열관측 후 7일이 되는 시점부터 균열치유제를 혼입한 박스형 암거에서 균열치유현상이 관측되었으며, 균열관측 후 28일이 지난 시점에서는 콘크리트 균열부가 Fig. 9에 보이는 바와 같이 약 90% 이상 균열치유물질로 채워져 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 이 연구에서 적용한 미생물 기반 균열치유제가 실험실 규모의 균열시편 뿐 아니라, 실 구조물 스케일의 콘크리트 균열 발생시에도 90%이상의 자발적 균열치유성능을 나타냄으로써 실제 현장에서의 실용화가 가능할 것으로 판단된다.

Fig. 9에서 콘크리트 균열부를 90%이상 치유한 균열치유물질이 콘크리트 배합 시 투입한 균열치유제 내부의 박테리아에 의해 발생한 것임을 검증하기 위해 균열치유물질을 채취하였고, 고체배지에 30℃ 조건에서 배양하였다. 배양 24시간 후 고체배지에 콜로니가 형성되었으며, 16S rRNA 염기서열분석을 통해 당초 균열치유제의 알지네이트 제작 시 첨가하였던 bacillus subtilis 균주임을 확인하였다.

Fig. 8 Box culvert(a, c; plain concrete / b, d: self-healing concrete)

Fig. 9 Cracks in box culvert with self-healing concrete

Fig. 10 Cracks in box culvert with plain concrete

2.2.2 실증시험체 균열치유물질 분석

균열부에 생성된 균열치유 추정물질이 탄산칼슘임을 검증하기 위해 이 샘플을 대상으로 탄산칼슘 결정 분석을 진행하였다. 미세구조 분석을 위해 SEM(scanning electron microscope) 촬영과 XRD(X-ray diffraction) 분석을 수행하였다. SEM 촬영 시 10,000배율로 설정하여 진행하였으며 Fig. 11과 같은 결정구조를 확인할 수 있었다. 샘플의 XRD 분석결과로 Fig. 12와 같은 peak 패턴이 나타났으며, 이를 탄산칼슘 결정 중 하나인 calcite reference 패턴과 비교하였다. 빨간색 선은 추출물질로부터 도출된 XRD 패턴을 나타내고, 파란색 선은 calcite reference 패턴이다. 두 그래프를 비교해보면, 거의 같은 값(X축)에서 X-ray 반사파의 intensity peak을 보임을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 균열부에서 추출된 물질이 다른 광물이 거의 혼합되어 있지 않은 균질한 탄산칼슘으로 구성된 calcite 결정임을 나타낸다. 따라서 SEM 사진 결과와 XRD 패턴으로 분석해 볼 때, 이 연구에서 진행한 실구조물 스케일의 실증시험체의 균열부에서 추출한 균열치유 추정물질은 균열치유제의 균열치유 미생물이 생성한 탄산칼슘 결정인 calcite인 것으로 사료된다.

Fig. 11 SEM images(x10,000)

Fig. 12 XRD red peak; white powder sample in concrete crack, blue peak; calcite reference peak