2.1.1 키토산과 알지네이트 담체 소재의 결합 메커니즘

콘크리트 내부의 강알칼리 조건에서 미생물의 활성을 유지하면서 균열 발생시 수분 흡수를 최대화하여 균열부위의 생체광물형성량을 극대화하기 위한 미생물 담체로서 하이드로젤 고분자 소재를 고려할 수 있다^{(Kim et al., 2009; Kim et al., 2010)}. 이 연구에서는 여러 하이드로젤 후보군들 중에서 세포 친화적이면서 음전하를 갖는 알지네이트(alginate) 고분자와 양전하를 갖는 키토산(chitosan) 고분자를 추가로 적용한 하이드로젤 소재를 개발하였다.

일반적으로 키토산은 새우, 게 등 갑각류에 많이 함유되어 있으며, 키틴을 알칼리 처리하여 얻는 글루코사민 중합체로 당(sugar)의 일종이다. 키토산은 분자구조가 인체조직과 매우 유사하여 인체 친화성이 우수하며, 많은 아민기를 가지고 있으므로 수분친화력이 뛰어나다. 알지네이트 또한 키토산과 마찬가지인 당으로 이루어진 고분자이며, 키토산과 달리 카복실기를 포함하여 음전하를 가지고 있다. 알지네이트에 의해서 형성되는 하이드로젤은 동물세포 배양에 많이 이용되고 있어 미생물과 같은 세포의 활성을 유지하는데 최적의 담체를 제공할 수 있다.

Fig. 1은 이와 같이 키토산 및 알지네이트가 결합된 키토산 하이드로젤 담체를 구성하는 기본 고분자 화학구조를 나타내고 있다. 최종적으로 키토산 하이드로젤 비드 담체는 아민기가 포함된 미생물 적합 키토산과 카복실기가 포함된 알지네이트를 포함하여 Ca²⁺ 이온과의 이온결합에 의해 생성된다.

키토산과 알지네이트 다중 폴리머(polymer) 고분자들은 각 성분의 질량 성분비를 조절하여 담체를 구성할 수 있으며, 키토산을 포함하지 않고 알지네이트와 Ca²⁺ 이온으로 이루어진 하이드로젤 고분자도 생성할 수 있을 정도로 이온결합력이 탁월하다. 여기서, Ca²⁺ 이온은 화학반응식에서 이온결합의 가교제(cross linking agent)의 역할을 한다.

Fig. 1 Chemical constitution of chitosan-alginate hydrogel

2.1.2 고분자 소재에 기반한 하이드로젤 비드 개발

이 연구에서는 스포어 형태의 미생물을 하이드로젤 내 포함하고 균일한 크기의 담체 비드를 제작하기 위하여 아래 Fig. 2와 같이 알지네이트 고분자 용액에 스포어를 포함하는 하이드로젤 비드 제작 방법을 적용하였다. 콘크리트에 혼입 전 스포어 활성을 최소화하기 위하여 하이드로젤 제작을 냉장 조건에서 실시하였다. 알지네이트 용액과 키토산/Ca²⁺ 이온을 포함하는 용액을 따로 준비하고, 이들을 적절한 비율로 혼합하는 과정에서 균일한 크기의 비드를 형성하도록 drop-wise addition 방법으로 하이드로젤 비드를 제작하였다.

이와 같이 제작된 하이드로젤 비드 내에 혼입된 미생물 영양세포의 생체광물형성 능력을 파악하기 위하여 Fig. 3과 같이 여러 조건의 영양성분을 포함하고 있는 환경하에서 생성된 생체광물을 SEM을 통하여 관찰할 수 있었다.

Fig. 2 Production of chitosan-alginate hydrogel bead carrier

Fig. 3 SEM monitoring microbial activity in hydrogel beads

Fig. 3에 보이는 바와 같이, 키토산을 함유한 경우 미생물의 영양분 성분 중 urea 및 CaCl₂의 공급 없이도 생체광물이 형성됨을 파악할 수 있었으며, 이로부터 콘크리트의 자기치유를 위한 균열치유물질인 탄산칼슘 생성량을 하이드로젤 비드에 포함되는 영양성분인 yeast extract와 urea 및 CaCl₂의 조절을 통하여 능동적으로 조절할 수 있는 것으로 판단된다.

2.2.1 담체 혼입을 위한 최적 균열치유 미생물 선정

이 연구에서는 콘크리트 균열의 자기치유성능을 극대화하기 위한 최적의 미생물군 선정을 위해 대전 소재 야산의 토양을 채취하여 분석을 진행하였다. 토양 입자에 흡착된 미생물을 분리하기 위해 1xPBS buffer(pH 7.4) 100ml에 시료 5g을 넣고 1시간 동안 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양액을 채취한 후 내생포자의 열저항성이 높은 특성을 이용하여 시료를 70℃에서 30분간 열처리를 수행하였고, 이를 Nutrient agar에 접종하여 배양하였다(30℃, 24시간). 배지에 자란 미생물 콜로니를 채취하여 16S rRNA 염기서열을 기반으로 동정하여 bacillus 종에 속하는 박테리아 3종을 Fig. 4에 보이는 바와 같이 분리하였다^{(Lee et al., 2023; Yu et al., 2023)}.

Fig. 4 Three bacillus species isolated from soil

Fig. 5 Bacteria endospores of three bacillus species

이렇게 분리한 3종의 박테리아를 대상으로 내생포자(endospore) 형성유무를 확인하기 위해 Table 1과 같은 조성의 DSM(Difo sporulation medium)에 30℃조건에서 48시간 배양하였고, Fig. 5에 보이는 바와 같이 위상차현미경을 이용하여 바실러스 계열의 길쭉한 영양세포 내에 생성된 둥근 형태를 갖는 내생포자의 형성을 관찰할 수 있었다. 모양이 길쭉한 간균에 속하는 바실러스 계열의 박테리아 영양세포내에서 원형형태의 내생포자의 생성유무는 이 원형 내생포자를 Fig. 2에 보이는 둥근 모양의 하이드로젤 비드내에 혼입하여 최종적으로 콘크리트의 자기치유를 유도하는 미생물 담체를 제작할 수 있다는 점에서 매우 중요하다 볼 수 있다.

이렇게 확보한 균주들의 생체광물형성 유무와 생성량을 정량적으로 측정하기 위하여, Table 2와 같은 조성을 갖는 탄산칼슘형성배지(CaCO₃ precipitation medium) 100ml에 같은 미생물 농도로 접종하여 30℃조건에서 72시간동안 배양하여 탄산칼슘생성 능력을 분석하였다.

이후 배양액에 lysozyme 처리를 하여 박테리아 세포를 분해하고, 원심분리를 수행하여 상층액(배지성분, 세포잔해물)과 침전물(생체광물)을 분리하였다. 최종적으로 이를 건조시켜 생성된 탄산칼슘의 중량을 측정하여 Table 3과 같이 생체광물형성량을 비교하였다.

세 균주 중 Bacillus subtilis가 가장 많은 양의 탄산칼슘 추정물질을 생성하였으며, 이 추정 물질의 정확한 성분 확인을 위해 샘플을 채취하여 Fig. 6에 보이는 바와 같이 XRD(X-ray Diffraction) 분석을 수행하였다. Fig. 6의 분석결과와 같이 탄산칼슘 추정물질의 peak는 시험기관에서 제공하는 calcite(탄산칼슘) 광물의 reference peak와 정확히 일치하는 것으로 나타났으며, 이로부터 가장 많은 탄산칼슘 추정물질을 생성한 Bacillus subtilis가 자기치유가 가능한 생체광물형성 미생물임을 확인하였다.

Fig. 6 XRD peak of biomineral sample and typical calcite

2.2.2 미생물 비드 담체 내 생체광물형성 반응 분석

미생물 담체 내 생체광물형성 반응을 검증하기 위하여 비드 담체 내에 포함되는 미생물 스포어, 키토산, urea, CaCl₂ 등의 혼입조건별로 TGA(Thermogravimetric Analyzer) 및 SEM 분석을 수행하였다. 분석 결과는 Fig. 7과 Fig. 8에 나타낸 바와 같으며, TGA 및 SEM 분석 결과 모든 조성물 혼입조건에서 생체광물형성작용이 발생하는 것으로 나타났다. 특히, TGA 분석결과 키토산을 함유하고 urea 및 CaCl₂를 포함한 미생물 비드 담체에서의 생체광물 형성량이 세가지 조건 중 최대로 나타났으며, SEM 분석 결과에서도 이 경우의 탄산칼슘 결정이 가장 크게 형성되는 것으로 나타나, 키토산, urea 및 CaCl₂를 혼합한 경우에 콘크리트 균열의 자기치유에 가장 효과적일 것으로 사료된다.

Fig. 7 TGA curve results of three compositions in hydrogels

Fig. 8 SEM results of three compositions in hydrogels

2.2.3 담체 내 미생물 활성화 조절 최적화

강알칼리성인 콘크리트 내부에서의 미생물 비드 담체 소재의 최적화를 위하여 이 연구에서는 Fig. 9에 보이는 바와 같이 하이드로젤 비드 제작 후 pH를 달리하여 하이드로젤의 물리적 특성을 분석하였다. 혼입되는 Ca²⁺이온 농도에 따라 차이는 있으나, 하이드로젤 비드 내 pH가 중성에 가까울수록 작고 단단한 하이드로젤 비드가 형성되었다. 또한 수분의 흡수 실험에서도 알칼리에서 중성에 가까울수록 수분을 흡수하여 비드 본래의 형태로 회복하는 능력이 높은 것으로 나타났으며, 이와 같은 사실은 향후 콘크리트에 혼입하는 하이드로젤 비드 담체의 제작 및 혼입할 경우 pH 7∼8 정도에서 미생물 보호 담체의 성능을 발휘할 수 있는 것으로 판단된다.

Fig. 9 Physical property change of hydrogels with pH change

콘크리트 균열환경에서의 하이드로젤 비드 내부의 수분 흡수에 따른 미생물 활성화 성능을 검증하기 위해 중성 및 강알칼리 환경에서 CaCO₃ 형성 여부에 대한 TGA 분석을 수행하였고, 그 결과는 Fig. 10과 같다. TGA 분석 결과, 강알칼리 환경(pH14) 조건에서는 TGA curve의 뚜렷한 drop이 발견되지 않아 CaCO₃ 형성이 미미한 것으로 나타났으나 중성 환경 조건에서는 비드의 수분 흡수, 재흡수시 CaCO₃ 형성이 활발한 것으로 나타났다. 따라서 콘크리트의 균열면이 중성으로 갈수록

Fig. 10 TGA results of hydrogels with pH change

균열부에 노출된 하이드로젤 비드의 수분 흡수와 건조, 재흡수시에 미생물이 활성화되어 균열의 자기치유가 가능할 것으로 사료된다.