2.1. 현장 자료 수집

2.1.1. 시료 채수

남조류 농도 분석을 위한 PC 추출용 현장 시료는 2015년 6월 17일부터 10월 7일까지 한강하류, 북한강 및 낙동강 유역을 대상으로 총 15회 채수 시료를 이용하였으며, 시료는 현장 녹조 발생 정도에 따라 10 ~ 50 L의 표층수를 식물플 랑크톤 네트를 이용하여 농축한 후(Fig. 1), 100 mL 광구 병에 담아 냉·암소 조건하에 운반하였다.

Fig. 1. Sample enrich for PC pigment extraction.

2.2. 기본 추출 이론

남조류는 구성성분 중 60 % 이상으로 가장 많은 양을 차 지하는 피코빌리단백질(phycobiliprotein)이 열린 고리 테트 라피롤 구조를 갖는 광합성 보조색소 역할을 하며, 남조류, 홍조류, 은편모조류에서 흔히 찾을 수 있다. 이 보조색소는 태양빛이 도달하는 지역이라도 그 양이 모자랄 경우, 태양 광선 중 광합성에 사용할 수 있는 파장 영역의 빛(Photosynthetically Active Radiation, PAR)을 효율적으로 사용하 기 위해 가지고 있는 색소를 말한다. 피코빌리단백질은 틸 라코이드(Thylakoid, 엽록소의 납작한 자루 모양의 구조) 막에 색소단백질체(Phycobilisome) 형태로 결합하고 있는 수용성 단백질(Fig. 2)로, 최대 흡광도에 따라 PC, 알로-피 코시아닌(Allo-Phycocyanin), 피코에리트린(Phycoerythrin)으 로 나뉜다(Fig. 3). 이들 중에서도 건조 중량의 20 %를 차 지하는 PC 농도를 기준으로 하면 남조류 농도 추정 정확 도를 더욱 높일 수 있다.

Fig. 2. Diagram of a typical cyanobacterial cell (Wikipedia).

Fig. 3. Structure of phycocyanin (http://www.nutraculture).

현재까지 국내에서는 PC 색소 추출을 위한 규정된 시험 법이 없으므로, 본 연구에서 다양한 실험분석을 통해 최적 의 추출 기법을 제시하고자 하였다.

PC 추출은 주로 ^{Sarada et al. (1999)}이 제시한 5가지 추출 법에 기초하며, 증류수에 담가 시간을 두고 자연적으로 추 출하는 방법(water extraction), 막자와 사발을 이용하여 세 포벽을 파쇄하는 외력을 가한 후 추출하는 방법(homogenisation of cells in a mortar and pestle), 동결과 해동을 반 복하여 얼음 결정에 의해 세포벽을 깨트리는 방법(freezing and thawing), 분쇄 기기를 이용하여 세포벽을 깨트린 후 추 출하는 방법(homogenisation in virtimixer at different speeds), 염산과 같은 세포벽을 깨트릴 수 있는 시약을 사용하여 추 출하는 방법(acid extraction)으로 구분된다. 증류수에 담가 추출하는 기법은 시간이 오래 걸리는 하나, 가장 간편한 추 출법이다. 동결 및 해동 추출법은 시간이 조금 걸리지만, 간 편하고 추출이 잘 되며 시료의 보관이 용이하다는 장점이 있다. 막자사발을 이용하여 세포벽을 파쇄하는 기법은 PC 추출이 잘 되긴 하나, 시료를 옮기고 담는 과정에서 손실이 발생할 수 있어 번거롭다. 이 외에도 초음파파쇄기(ultrasonicator), 믹서기(virtimixer), 유리 bead, 액화질소(nitrogen cavitation) 를 이용하여 파쇄하는 기법은 시간을 단축시킬 수 있으 나, 도구의 외력을 적절하게 조절하는 과정이 필요하다. 이 에, 다음 Table 1에 정리된 대표적 PC 추출 사례를 기반으 로 다양한 실험 조건을 결정하였다.

추출 과정 중 완충 역할을 위해 주로 사용되는 용매는 distilled water, Phosphate buffer 0.05 ~ 1 M, Acetate buffer, Lysozyme, NaCl 0.15 M, CaCl2 10 g/L가 있다. ^{Mogany (2014)}는 PC 추출 변수를 다양하게 제어하며 비교 연구를 수행하였으며, 5가지 버퍼(acetate buffer pH 6.8, ultrapure water 18.2 M Ω, potassium phosphate buffer 10 mM pH 7.0, sodium phosphate buffer 10 mM pH 7.0, tris chloride buffer pH 7.4, tris base 1 M pH 7.4 + EDTA)에 따른 PC 추출 농도 (μg/mL) 비교 값을 제시하였다. 그 결과 sodium phosphate buffer룰 사용했을 때 가장 높게 추출되었으며, 몰 농도는 50 mM일 때 가장 효과적인 것으로 나타났다.

추출된 PC의 농도는 흡광도 측정 후, 다음 식 (2)에 따라 산정한다(^{Bennett and Bogorad, 1973}).

여기서, OD는 UV 흡광도(optical density), V₁은 상층액 의 양(mℓ), 그리고 V2는 여과한 시료의 양(ℓ)을 의미한다.

3.1. 추출 기법 비교

3.1.1. 예비 실험

추출 기법별 비교 및 최적화를 위해 2015년 6월부터 8월 까지 총 4개 시료를 이용하였으며, ^{Simis et al. (2005)}이 제안한 기법을 기초로 예비 실험을 수행하였다.

분석에는 2015년 6월 17일 북한강 의암호에서 채수한 20 지점 농축 시료를 사용하였으며, 20 mL를 분취하여 15 mL 원심관에 담아 초음파파쇄기로 30초씩 5번 균질화시킨 후, 1차로 원심분리(25,000 ×g, 4 °C, 20 분)하였다. 분리 후 상등액을 제거하고, 완충용 phosphate buffer(pH 7.2) 5 mL 를 추가하여 -20 °C에서 24시간 동결하였다. 시료의 해동 및 원심분리 과정을 거친 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 620 nm와 652 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

예비 테스트를 통하여 PC 농도 추출이 어느 정도 유의한 지 확인하기 위해 현미경을 이용하여 남조류 세포수를 계 수했으며, 비교 결과는 Fig. 4와 같이 결정계수 R²는 0.6으 로 비슷한 경향을 보였다. 또한 각 지점별 PC 농도와 남조 류 세포수도 유사한 패턴을 나타냈다(Fig. 5).

Fig. 4. Relationship between PC concentration and cyanobacteria cells.

Fig. 5. PC concentration and cyanobacteria cells of each sampling sites.

3.1.2. 조건별 비교 실험

첫 번째로 여과지의 사용 여부를 결정하기 위해 GF/F에 여과한 시료와 여과하지 않은 농축시료를 이용하였으며, 동 결과 해동 반복 횟수 증가 및 세포벽 파쇄를 위한 초음파 파쇄 강도 단계에 따른 비교 실험을 수행하였다. 본 분석 에는 2015년 7월 1일 한강 행주대교에서 채수한 시료를 사 용하였으며, 결과는 Table 2와 같이 시료를 여과하지 않은 상태로 동결 및 해동 후 세포벽 파쇄 단계로 이어지는 과 정이 더 높은 농도를 추출할 수 있었다.

Table 2. Different twelve cases for PC concentration extraction

Protocol			Absorbance		Phycicyanin concentration (mg/m3)
Freezing & Thawing	Filter homogenization	Sonication (times)	620 (nm)	652 (nm)
1 time	○	0.5 min (3)	0.04706	0.02004	52.75
		1.0 min (6)	0.06658	0.02483	76.98
		1.5 min (9)	0.07763	0.03075	88.56
	×	0.5 min (3)	0.05792	0.02548	64.39
		1.0 min (6)	0.11611	0.05573	125.98
		1.5 min (9)	0.12678	0.06435	135.22
2 times	○	0.5 min (3)	0.04995	0.02124	56.02
		1.0 min (6)	0.05081	0.02170	56.91
		1.5 min (9)	0.05381	0.02470	59.13
	×	0.5 min (3)	0.04704	0.02123	51.93
		1.0 min (6)	0.05336	0.02303	59.61
		1.5 min (9)	0.05477	0.02528	60.10

동결 및 해동은 1회 실시하였을 경우가 2회 보다 더 높은 값을 보였는데, 이는 동결 및 해동 과정 중 초음파파쇄를 2 회 실시함에 따라 상대적으로 빛, 온도와 산소에 약한 PC의 손실이 발생한 것으로 판단되었다. ^{Edwards et al. (1997)} 연 구 결과에 따르면, PC는 온도에 의해 변성이 발생하며 특히 60 °C ~ 70 °C 에서 빠르게 변성하는 것으로 나타났다. 본 실험에서 초음파파쇄 시 시료의 온도가 40 °C ~ 50 °C 까지 상승하는 것을 확인하였으며, 이미 파괴된 PC 단백질 단량 체가 2회차 초음파파쇄 과정 중에 상승한 온도에 의해 변성 을 일으킨 것으로 사료된다. 또한 ^{Sarada et al. (1999)}의 연 구에서도 PC의 안정성은 5가지 온도조건에 따라 크게 손실 (감소)되는 결과를 보이는 것을 확인할 수 있다.

두 번째로 동결 및 해동 중간과정 초음파파쇄에서 오는 손실 체크를 위해 위 실험과 동일하게 수행하되, 여지는 사용하지 않고 초음파 파쇄 강도만 바꾸어 추가 실험을 실 시하였다. 그 결과 동결 및 해동 1회, 파쇄는 200W로 5초씩 6회(총 1분) 수행 시 흡광도가 가장 높게 나타났다(Table 3).

Table 3. Different fifteen cases for PC concentration extraction

Protocol			Absorbance		Phycicyanin concentration (mg/m3)
Freezing & Thawing	Sonication (times)		620 (nm)	652 (nm)
1 time	70W	0.5 min (3)	0.04785	0.02319	51.76
		1.0 min (6)	0.07106	0.04197	71.87
		1.5 min (9)	0.05807	0.03296	59.62
	200W	0.5 min (3)	0.05465	0.03086	56.21
		1.0 min (6)	0.08909	0.06091	84.58
		1.5 min (9)	0.06753	0.04791	62.94
2 times	1 time 70W	0.5 min (3)	0.07964	0.04730	80.36
		1.0 min (6)	0.06378	0.04645	58.65
		1.5 min (9)	0.05848	0.04828	50.00
	1 time 200W	0.5 min (3)	0.08394	0.05110	83.88
		1.0 min (6)	0.07928	0.05708	73.35
		1.5 min (9)	0.08852	0.06689	79.80
	2 times 200W	0.5 min (3)	0.06401	0.04023	63.12
		1.0 min (6)	0.06588	0.05815	53.81
		1.5 min (9)	0.06156	0.07256	38.15

지금까지의 실험을 통해 동결 및 해동 이후의 파쇄는 손 실을 야기할 수도 있으며, 여지의 사용이 흡광도 측정에 오차를 가져올 수 있다고 판단하였다. 따라서 세 번째 실 험에서는 여지를 사용하지 않고 농축 시료 원액 상태로 사 전 균질화 과정만으로도 결과에 어느 정도 영향을 미치는 지 확인하고자 하였다. 시료는 2015년 8월 3일 낙동강 강 정고령보에서 획득하였으며, 초음파파쇄 시간은 사전 균질 화 의미로 짧게 5 초간 3회, 6회, 12회, 18회, 24회, 30회 로 6가지 비교 실험을 실시하였다(Table 4). 오차를 줄이기 위해 각 방법별 동일 시료는 3회씩 연속 측정하여 평균하 였다. 실험결과, 사전균질화 단계에서도 과하게 세포벽이 파쇄 되었을 경우, Chl-a 색소가 추출되어 670 nm 근처 및 620 nm 까지 영향을 미치는 것을 확인하였다. Chl-a 색소 에 의한 흡광도 영향을 최소화하고자 670 nm 파장 근처에 서 Chl-a 간섭을 최소화 할 수 있는 적절한 균질화 시간은 30 초 내지 1 분으로 판단되었다(Fig. 6).

Table 4. Different six cases of pre-homogenization test for PC concentration extraction

Protocol		Absorbance		Phycicyanin concentration (mg/m3)
Sonication		620 (nm)	652 (nm)
1	5 s, 3 times (total 0.5 min)	0.02143	0.01245	1.5
2	5 s, 6 times (total 1min)	0.02567	0.01578	1.7
3	5 s, 12 times (total 2min)	0.03049	0.02026	2.0
4	5 s, 18 times (total 3min)	0.04335	0.03239	2.6
5	5 s, 24 times (total 4min)	0.03689	0.02638	2.3
6	5 s, 30 times (total 5min)	0.02939	0.02026	1.9

Fig. 6. Comparison of samples absorbance by six cases on difference pre-homogenization time.

네 번째로 사전 균질화 시간 두 가지 경우(5 초간 3회, 6 회)를 기준으로 동결 및 해동 횟수(1회, 2회, 3회, 4회, 5회) 에 따른 결과를 비교해 보았다(Table 5). 시료는 2015년 8월 9일 북한강 공지천 유입부에서 채수하였으며, 각 방법별 2회 씩 흡광도를 측정하고, 각 시료량은 처음 50 mL 사전 균질 화 이후 5 mL 씩 나눠 담아 동결 및 해동을 실시하였다. 그 결과, 동결 및 해동 2회 시행 값이 가장 높았으며, 그 이후 다시 감소하는 경향을 보였다. 전체적으로 동결 및 해동 1 ~ 2회 만으로도 충분한 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

Table 5. Different nine cases for PC concentration extraction

Sonication (5 sec interval)		Freezing & Thawing	Absorbance		Phycicyanin concentration (mg/m3)
			620 (nm)	652 (nm)
1	5 s, 3 times (total 0.5 min)	1 time	0.049082	0.03009	3.91
2		2 times	0.069748	0.037484	5.84
3		3 times	0.058267	0.031201	4.89
4		4 times	0.057445	0.031039	4.80
5	5 s, 6 times (total 1 min)	1 time	0.056273	0.033422	4.54
6		2 times	0.055748	0.030842	4.62
7		3 times	0.051777	0.027302	4.36
8		4 times	0.052193	0.028413	4.35
9		5 times	0.051668	0.026746	4.38

3.2. 추출 기법 최적화

비교 실험 결과 PC가 가장 안정적으로 추출되는 기법은 동결·해동 기법을 기반으로, 초음파 파쇄기(200 W)를 이용 하여 30 mL 시료를 50 mL 원심관에 담은 후, 5 초간 3회 (총 30 초) 동안 시료를 사전 균질화 하는 것으로 판단되 었다. 이후, 원심분리(4,000 rpm, 5 °C, 15 분)를 시켜 상등 액은 따라 버리고 남은 pellet에 5 mL 완충용 phosphate buffer(pH 7.2)를 추가하여 -20 °C에서 24시간 동결 및 해동 후, 색소가 buffer에 잘 스며나오도록 진탕 배양기(shaking incubator)에서 37 °C 조건으로 15분간 교반 하여 색소가 고 루 용해되도록 하는 추가 과정을 거치는 것이 효과적인 것 으로 사료되었다. 2차 원심분리 과정을 거친 후 색소가 추 출된 시료는 상등액을 적당량 분취하여 분광 광도계로 전 파장 측정 후(Fig. 7), 620 nm 및 652 nm에서의 흡광도를 선택하여 수식 1에 의해 최종 PC 농도로 환산한다.

Fig. 7. Schematic diagram of PC extraction.

3.3. PC 추출기법 적용 및 평가

6월부터 8월까지 테스트를 위한 4회차 시료를 제외하고, 9월 이후 11회 추가 획득한 시료에 최적화 기법을 적용하 여 추출한 PC 결과는 다음 Table 6과 같다. PC 농도는 평 균 2.9 ~ 51.9 mg/m³ 분포를 나타냈으며, 주로 북한강 수계 의암호에서 낮은 농도를 보였다. 전반적으로 한강하류에서 높은 값을 보였으며, 특히 10월 7일에 281.9 mg/m³로 최대 값을 보였다. 현장에서 시료 채수와 동시에 측정된 Rrs는 수계별로 유사한 반사 스펙트럼을 보였으며, 공통적으로 620 nm 파장에서 PC에 의한 흡수 피크와 675 nm 파장에 서 Chl-a에 의한 흡수 피크가 관찰되었다(Fig. 8).

Fig. 8. Measured remote sensing reflectance in four river basins; (a) Nakdong river, (b) Bukhan river, (c) Han river, and (d) Geum river respectively.

추출법을 통한 결과를 원격반사도 Rrs를 이용하여 ^{Simis et al. (2007)}의 알고리즘에 의해 계산된 PC 농도와 비교한 결과, R²가 0.61로 유사한 정확도를 보였다(Fig. 9). 한강하 류에서 실측한 지점 중 PC 농도가 매우 높았던 일부 지점 을 제외하고는 즉각적으로 현장 PC 농도를 파악하기 위한 Rrs의 활용은 적절한 것으로 사료되었다. 다만, 수체 내 남 조류가 가진 총 PC 색소의 회수율이 100 %는 아니므로 추출 순도를 평가하기에는 무리가 있으나, 유해한 조류의 대발생과 동시 수체 현황을 즉각적으로 파악하는 원격탐사 기법에는 활용도가 높을 것으로 기대된다.

Fig. 9. Correlation of the Rrs and measured PC.