2.1. 대상물질의 선정

대상물질은 『2014년도 국가항생제 사용 및 내성 모니터링』 (^{Lim et al., 2015})자료를 바탕으로 소, 돼지, 닭 사육 목적 으로 판매된 항생제의 판매량을 고려하여 결정하였다. 선행 연구에서 총 37종의 항생제가 선정 되었고 EPA method 1694를 적용할 수 있는 물질들을 대상으로 분석방법을 조 사한 바 있어(총설 IV) 본 연구에서는 EPA method 1694를 적용할 수 없는 물질 21종(9개 계열)을 대상물질로 분류하 였다(Table 1).

2.2. LC-MS/MS 분석

액체(지표수, 하수 등), 고체(가축분뇨, 퇴비, 토양 등)의 환경 시료대상물질로 선정된 21종의 항생제를 LC-MS, LC-MS/MS, LC-MS/TOF, LC-MS/Orbitrap 등의 방법으로 분석한 문헌 을 검토하여 LC와 MS의 분석조건을 고찰하였다. LC 조건 으로는 사용된 컬럼의 종류와 온도, 이동상의 종류 등을 조사하여 항생제 종류에 따른 분석방법의 유사성이나 특이 성 등을 검토하였다. 질량분석기 조건으로는 대상물질에 따 른 분석기기의 종류, 이온화방식, 전구물질과 전이물질들의 질량 대 전하 비(mass to charge ratio, m/z), 전이체 생성을 위한 collision energy 등을 조사하였다.

2.3. 분석방법의 검증

개발 및 적용된 분석방법에 대한 검증을 위해 각 문헌에서 제 시한 표준용액의 선형 구간(linear range), 상관계수(correlation coefficient, r²), 회수율(recovery), 시험방법의 검출한계 및 정량한계 등을 비교하여 정리하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)는 검출 가능한 최소량을 의미하며 정확한 정량은 불가능한 농도이다. 기기에 시료를 직접 주입하여 측정되는 기기검출한계(instrument detection limit, IDL)와 전처리를 포함한 전체 분석과정과 매질의 특성을 고려하여 결정되는 방법검출한계(method detection limit, MDL)로 구 분한다(^{NIER, 2011}). 정량한계(limit of quantification, LOQ) 는 검출 한계보다 높은 농도로 정확한 정량이 가능한 가장 낮은 농도를 의미한다. 검출한계와 동일하게 기기정량한계 (instrument quantification limit, IQL), 방법정량한계(method quantification limit, MQL)로 구분하기도 한다(NIER, (²⁰¹¹). 아미노글리코사이드계열의 항생제를 대상으로 한 경우 검 출한계 및 정량한계를 대신하여 결정 한계(decision limit, CC_α)와 탐지 역량(detection capability, CC_β)을(^{EU Commission, 2002}) 계산하여 방법을 검증하는 경우가 많아 이에 대한 조사와 고찰을 수행하였다.

3.1. 컬럼의 종류

Table 2는 대상 항생제에 적용한 분석 방법과 크로마토 그래피에 사용된 컬럼, 이동상의 종류를 나타낸다. 항생제 계열에 따른 큰 차이가 관찰되지는 않았으며 대부분의 문 헌은 비극성 고정상과 극성 용매를 이동상으로 사용하는 역상 C₁₈ 컬럼을 사용하는 것으로 조사되었으나 특정 계열 의 항생제를 분리하기 위한 목적으로 C₈, phenyl 컬럼 또는 CAPCELL PAK ST 컬럼이 적용된 연구도 있다.

Table 2. Comparison of chromatographic conditions for detection of the 21 selected antibiotics (FA: formic acid; ACN: acetonitrile; RRLC: rapid resolution liquid chromatography; UPLC: ultra performance chromatography; AF: ammonium formate; MeOH: methanol; HFBA: heptafluorobutyric acid; TFA: trifluoroacetic acid; TEA: triethylamine)

계란과 새의 근육에서 이오노포어계열의 항생제를 포함 한 총 20종의 항콕시듐제의 잔류 농도를 측정한 ^{Moloney et al. (2012)}의 연구에서는 C₈ 컬럼을 사용하기도 하였는데 극성이 없는 이오노포어계열의 항생제가 C₁₈ 컬럼에 비해 소수성이 약한 C₈ 컬럼에서 더 빠르게 용리될 수 있기 때 문이다. ^{Nebot et al. (2012)}과 ^{Iglesias et al. (2012)}은 각각 18종, 21종의 동물용 의약품의 잔류량 측정에 Synergi Polar RP 컬럼을 사용하였다. Synergi Polar RP 컬럼은 실 리카 입자에 phenyl이 결합되어 있는 구조로 C₁₈ 컬럼을 보완하기 위해 개발되었다. 이 컬럼은 물질 분리할 때 극 성 뿐 아니라 벤젠고리의 파이(π)결합을 이용하기 때문에 방향족화합물과의 결합력이 상대적으로 높아 보다 넓은 선 택성을 갖는 것으로 알려져 있다. ^{Tao et al. (2012a)}은 15 종의 아미노글리코사이드계열의 항생제를 분석하였는데, 친 수성이 강한 스트렙토마이신(streptomycin)을 분리하기 위해 개발된 CAPCELL PAK ST 컬럼을 사용하기도 하였다.

HPLC의 경우 2.2~5.0 μm 사이의 입자크기를 갖는 고정 상으로 충전된 100~150 mm의 길이의 컬럼을 주로 사용한 다. 2010년 이후에 수행된 대다수의 연구에서는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 기술이 적용되고 있는 것으로 조사되었는데 2 μm 이하의 크기를 갖는 입자로 충전된 길 이가 짧은 컬럼(50~100 mm)을 사용한다. 컬럼의 길이가 감소한 만큼 상대적으로 짧은 시간에 물질의 분리가 이루 어지는 장점을 가지고 있으며 좁고 높은 피크(peak)로 인해 향상된 분해성능을 나타낸다.

3.2. 이동상의 선택

LC에서 이동상 물질은 보통 극성용매와 비극성용매를 혼 합하여 사용하고 있는데, 극성용매로는 물, 비극성 용매로 는 아세토나이트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol) 또는 아 세토나이트릴과 메탄올의 혼합액을 주로 사용한다. 극성과 비극성 물질의 혼합 비율은 컬럼을 지나가는 입자의 머무 름 시간(retention time)에 영향을 미친다. 물과 비극성 물질 을 용매로 사용하는 조건에서, 비극성 용매의 극성이 낮은 경우 용출속도가 증가하여 짧은 머무름 시간을 갖고 극성 이 높은 경우에 상대적으로 긴 머무름 시간을 갖는 특성을 나타낸다. 특히 극성 정도가 다른 비극성물질의 혼합액을 용매로 사용하는 경우 혼합용매의 혼합비율이 머무름 시간 에 영향을 미치기도 한다. 모든 연구가 복잡한 시료에서 하나 이상의 다양한 종류의 물질을 분류하는 것을 목적으 로 하기 때문에 극성용매와 비극성용매의 혼합비율을 시간 에 따라 변화시키는 구배용출법(gradient elution)을 적용하 고 있다. 아미노글리코사이드계열의 항생제를 분석한 논문 을 제외한 나머지 연구에서는 0.01~0.5% 농도로 포름산 (formic acid)이나 포름산암모늄(ammonium formate)을 이동 상 용매에 첨가하는 것으로 나타났다. 이러한 휘발성 첨가 제를 첨가함으로 인해 분석대상 항생제의 이온화 효율과 질량분석기의 감도(sensitivity)를 향상시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다(^{Seifrtova et al., 2009}). ^{Amelin and Timofeev (2016)}, ^{Wei et al. (2015)}는 이동상에 초산암모늄(ammonium acetate)을 첨가제로 투입하였는데 포름산암모늄과 마찬가지 로 질량분석기의 민감도를 향상시켜 피크의 세기를 증가시 키는 역할을 하는 것으로 나타났다. ^{Amelin and Timofeev (2016)}는 모넨신(monensin), 나라신(narasin) 등을 분석하였 는데, 초산암모늄의 투입에 의해 피크의 세기가 2배까지 증가됨을 보고하고 있다. 이동상에 대한 다양한 연구들이 있었으나 포름산과 아세토나이트릴, 물을 혼합하여 구배용 출법을 사용하는 경우 좌우 대칭을 이루는 피크와 가장 높 은 분해능을 나타내고, 포름산의 첨가로 인해 충분한 이온 화가 진행됨과 동시에 피크의 테일링(tailing) 현상이 최소 화되는 것으로 알려져 있다(^{Nebot et al., 2012}).

3.3. 아미노글리코사이드 계열의 항생제 분리

총설 I, II의 결과 아미노글리코사이드 계열의 항생제는 타 계열의 항생제에 비해 매우 높은 친수성을 가지고 있기 때문에 전처리 과정에서도 구별된 방법의 적용이 필수적인 것으로 알려져 있다. 동일한 화학적 구조와 특성으로 인해 항생제 분석에 일반적으로 사용되는 C₁₈ 역상 크로마토그 래피 컬럼들에 의한 분리의 어려움이 다수 보고되어 왔다 (^{Farouk et al., 2015}; ^{Kaufmann et al., 2012}; ^{Oertel et al., 2004}). 역상 컬럼에서는 분자 극성의 차이를 바탕으로 고정 상과 극성결합을 하려는 성질과 이동상에 의해 용리되려는 성질의 크기에 따라 물질이 분리되는데, 친수성이 매우 높 은 아미노글리코사이드 계열의 항생제는 극성결합을 통해 컬럼의 고정상에 머무르기 힘들고 머무름 시간의 차이를 이용한 물질 분리가 어렵기 때문이다.

최근의 연구에서는 이온쌍 크로마토그래피(ion-pair chromatography, IPC)나 친수성 상호작용 크로마토그래피 (hydrophilic interaction chromatography, HILIC)기법을 이용 한 물질 분류 기술을 사용한다. 이온쌍 크로마토그래피는 분리대상물질이 이온으로 해리되는 친수성 물질을 분리할 때 사용되는 방법으로 이온쌍 시약(ion-pair reagent)을 사용 한다. 이동상에 첨가하는 이온쌍 시약은 소수성을 띄는 컬 럼의 충전물질 표면에 머무르게 되고 주입되는 시료 중에 이온 형태로 존재하는 분리대상물질들은 이온쌍 시약과의 이온교환(ion-exchange) 과정을 통해 물질간의 머무름 속도 차이가 발생하여 순차적인 물질의 분리가 일어난다. 기본적으 로 이동상으로는 물과 아세토나이트릴을 사용하며 이온쌍 시 약으로는 트리플로로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)(^{Tao et al., 2012a}; ^{Vucicevic-Prcetic et al., 2011})과 헵타플로로 부티르산(heptafluorobutyric acid, HFBA)(^{Kaufmann et al., 2012}; ^{van Holthoon et al., 2009}; ^{Zhu et al., 2008})을 주로 사용하는 것으로 조사되었다. TFA의 농도가 0.1%일 때 피 크의 모양과 분해능이 향상되는 것으로 나타났으며 ^{Tao et al. (2012a)}는 TFA의 농도를 0.005~1%로 변화시키면서 피 크의 모양을 분석하여 15종의 아미노글리코사이드계열의 항생제 분석에 적합한 농도를 0.1%로 보고하였다.

친수성 상호작용 크로마토그래피가 적용된 연구들은 2000년 대 초반부터 급격히 증가하였는데 역상 컬럼에서 분리가 어려운 탄수화물(^{Churms, 1996}; ^{Hao et al., 2007}), 펩타이 드(^{Hao et al., 2007}; ^{Yoshida, 2004}) 또는 극성 의약물질(^{Li and Huang, 2004}; ^{Zhu et al., 2008}) 등을 분리할 목적으로 적용된다. Diol, amino, amide 등의 극성 작용기로 치환되 거나 쌍성 이온(zwitterion)과 공유결합으로 결합된 실리카 입자를 고정상으로 하는 컬럼을 사용하고 역상 크로마토그 래피에서 사용하는 극성, 비극성 용매를 이동상으로 사용한 다. 아세토나이트릴과 물이 가장 많이 사용되며 초산암모늄 이나 포름산암모늄을 첨가물로 사용하기도 한다(^{Vucicecic-Prcetic et al., 2011}; ^{Zhu et al., 2008}). 이러한 첨가제는 이 동상의 pH와 이온강도를 제어하는데 기여하며, 비대칭적인 피크와 테일링 현상을 감소시키고 고정상에서의 회수율을 향상시키는 역할을 한다. 특히, 아미노글리코사이드계열의 항생제와 같이 이온화되는 물질들은 단일 이온의 형태로 존재할 수 있는 pH로 조절되어야 한다고 보고되고 있다 (^{Buszewski and Noga, 2012}).

높은 비율의 비극성 용매를 포함하는 이동상이 컬럼을 흐를 때 친수성 정지상 입자 표면 가까이에 물 층이 형성 된다. 시료가 주입되고 이동상에 흐르는 분석물질은 강한 극성을 가지므로 친수성 환경인 물 층으로 이동하고 머무 름을 갖게 된다. 서서히 이동상의 극성 용매 분율을 감소 시키면 친수성 정도의 차이에 따라 컬럼 내에 물 층에 머 무르던 분석 물질들이 순차적으로 분리된다. 유기용매의 분 율이 높을수록 머무름 시간이 증가하며 물의 분율이 증가 하면 물질이 분리되어 용리가 진행된다. 이동상에서 적절한 물의 비율은 컬럼의 종류에 따라 차이가 있으나 최소 3~5%, 최대 60%를 넘지 않는 것으로 나타났다(^{Appelblad et al., 2008}).

4.1. 이온화

의약물질의 분석을 위해 LC-MS, LC-MS/MS 등을 이용할 때 가장 많이 사용되는 이온화 방법은 전자분무이온화(electrospray ionization, ESI)법과 대기압화학이온화(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)법이 있다. ^{Schlusener et al. (2003a)}은 APCI법을 이용하기도 하였으나 동물용 항생제를 분석한 대부분의 연구들은 ESI 방법을 사용하는 것으로 나 타났다(Table 3). ESI 기술은 극성, 비극성 물질에 모두 적 용이 가능하며 열에 의해 변하기 쉬운 물질의 분석에 매우 효과적이다. ^{Schlusener and Bester (2005)}는 하수처리장 유 입수와 유출수에서 호르몬과 매크로라이드 계열의 항생제 를 분석하면서 APCI와 ESI의 성능을 비교하였는데, 매크로 라이드 계열의 항생제에 대해서 ESI 방법을 적용한 결과 더 좋은 민감도를 나타내는 것을 관찰하였고, ^{Stolker et al. (2004)}는 3종의 항생제를 포함한 13종의 의약물질 분석 결 과 APCI 방식 보다 ESI방식을 사용한 경우에 10배 이상의 민감도를 나타내는 것을 관찰하였다.

Table 3. Comparion of mass spectrometric conditions for detection of the 21 selected antibiotics

ESI법은 positive 또는 negative 방식으로 이온화를 수행 하며 분석대상 물질은 화학적 특성에 따라 양성자를 얻거 나([M+H]⁺) 잃은([M-H]^-)형태의 전구이온으로 변환되는 것 이 일반적이다. 대부분의 항생제는 비휘발성과 높은 분자량 을 갖고 있고 positive 방식에서 쉽게 이온화된다(^{Seifrtova et al., 2009}). ^{Hao et al. (2006)}은 27종의 항생제를 분석하 였는데 대부분의 항생제는 주로 positive 방식에서 쉽게 이 온화가 일어나는 것을 확인 하였고, 설폰아마이드계열의 항 생제는 positive와 negative방식 모두에서 이온화가 잘 이루 어지는 것을 확인하였으나 positive 방식을 적용하고 있다. 조사 결과 암페니콜계열의 클로람페니콜(chloramphenicol), 플로르페니콜(florfenicol)을 분석한 연구들은 negative 방식 의 이온화 방법을 적용하여 [M-H]^-형태의 전구이온을 형성 시키는 것으로 나타났으며 나머지 물질들은 positive 방식 의 ESI를 적용하는 것으로 조사되었다(Table 3). 아미노글 리코사이드계열의 항생제인 스펙티노마이신(spectinomycin) 은 [M+H₂O+H]⁺형태, 이오노포어계열의 항생제인 라살로시 드(lasalocid), 모넨신, 살리노마이신(salinomycin)은 나트륨 이 결합된 [M+Na]⁺의 형태로 이온화되는 것으로 나타났으 며 나머지 물질들은 수소이온과 결합한 [M+H]⁺ 형태로 이 온화가 이루어진다.

4.2. Detection mode

선정된 동물용 항생제의 분석을 위해 사용된 분석기법에 서는 HPLC에서 분리된 대상물질을 이온화하여 MS/MS, MS/TOF, MS/Orbitrap 등 연속된 질량분석기에서 검출한다. 선택반응검출(selected reaction monitoring, SRM) 방식을 주로 사용하는데 이온화된 전구이온을 첫 번째 질량 분석 기에서 분리하고 일정한 충돌 에너지(collision energy)를 가하여 쪼갠 후 두 번째 질량 분석기에서 쪼개진 이온들을 검출한다. 일반적으로 두 번째 질량분석기에서 검출되는 물 질들(fragments) 중 가장 강한 신호를 갖는 물질을 원 물질 의 농도를 정량하기 위한 전이체로 간주하며 두 번째로 강 한 신호를 갖는 물질은 모 분자의 분자구조를 검증할 목적 으로 확인한다. SRM 모드는 정확성과 민감도를 향상시킬 수 있는 유용한 방법으로 알려져 있으나 분석대상물질들이 정해지고 각 물질들에 대한 전구 이온(precursor ion)과 전 이체(transitions)가 갖는 질량 대 전하 비(m/z)를 아는 경우 에 적용 가능 하며 full scan 방식과는 달리 추가적인 미지 물질은 검출하지 못하는 한계가 있다. 본 연구에서 선정된 항생제 종류에 따른 전구이온과 전이체가 나타내는 질량 대 전하 비(m/z)는 Table 3에 정리하였다.

5.1. 분석방법의 검증 기준

검증과정은 분석 방법을 통해 대상 물질을 정확히 식별 하고, 정량할 수 있는지에 대한 성능을 평가하는 단계로 신뢰할 수 있는 분석방법을 개발하기 위해 반드시 필요한 절차이다. 우리나라의 경우 국립환경과학원에서 발간한 환 경시험·검사 QA/QC 핸드북에 분석방법의 검증을 위한 구 체적인 방법을 설명하고 있다(^{NIER, 2011}).

시험방법의 검증은 직선성(linearity), 범위(range), 정확도, 정밀도(precision), 검출한계, 정량한계 등을 고려하는 것으 로 나타났다. 검정곡선의 선형관계는 선형 회기분석(linear regression)을 통해 구해진 상관계수인 r²값을 고려하여 평 가하고 검출농도를 포함할 수 있는 범위를 대상으로 직선 성이 검증되어야 한다. 회수율은 전처리와 기기분석 전 과정 에서 나타나는 분석대상물질의 손실율을 고려한 값으로 상 대 정확도(relative accuracy)로 정의되기도 하며, 분석결과의 정확도(accuracy)를 평가하는 척도로 사용되는데(^{NIER, 2011}) 항생제 분석 시 고려되는 회수율은 시료 전처리 과정의 효율을 평가하는 기준으로 사용되는 경우가 많다. 정밀도를 나타내 기 위한 방법으로는 표준편차(standard deviation), 표준 오차 (standard error), 분산(variance), 상대표준편차(relative standard deviation, RSD) 등이 있으나(^{NIER, 2011}) 일반적 으로는 상대표준편차와 변동계수 (coefficient of variance, CV)로 정밀도를 평가하고 있다. LOD와 LOQ는 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, S/N)를 바탕으로 결정하거나 미국의 수질오염방지법(Clean Water Act)에서 제시한 방법 을 사용한다. 신호 대 잡음비를 사용하는 경우 S/N이 3, 10이 되는 농도 값을 각각 LOD, LOQ로 결정한다. 미국의 수질오염방지법에서는 검출한계 부근의 낮은 농도를 갖는 최소 7개 시료를 분석하고 측정값의 표준편차에 3.143(신 뢰도 98%, 자유도 6에 대한 값), 10을 곱하여 각각 LOD, LOQ로 결정한다. 미국공중보건협회(American Public Health Association, APHA), 미국수도협회(American Water Works Association, AWWA), 미국물환경연합(Water Environment Federation, WEF)에서 발간하는 표준시험방법(standard method for the examination of water and wastewater)과 미국재료 시험학회(American Society for Testing and Materials, ASTM) 의 시험방법에서도 미국 수질오염방지법에서 정의한 LOD 를 사용하고 있다(^{NIER, 2011}).

유럽연합 집행위원회(European Commission)는 2002년 동 물성 식품들에 잔류하는 오염물질의 분석방법과 성능을 평 가하기 위한 기준을 발표하였다(^{EU Commission, 2002}). 항 생제를 포함하여 동물용 의약품 및 살충제 등 미량 환경오 염 물질 등에 대해 적용 가능한 분석 기법(technique)을 제 시하고 있으며 정확도, 진도(trueness)/회수율, 정밀도, 반복 성(repeatability), 재현성(reproducibility), 검정곡선, 결정 한 계, 탐지 역량 등의 검증 항목을 정의하고 측정 방법을 설 명한다(^{EU Commission, 2002}). 분석 목적(스크리닝 또는 정량), 검출 농도 범위, 분석 기법 등에 따라 검증이 필요 한 항목들과 검증기준을 제시한다.

5.2. 동물용 항생제 분석방법의 검증

본 연구에서는 검정용액의 농도 범위와 직선성(linearity), 시료의 종류와 회수율, 방법검출한계(method detection limits, MDL), 방법정량한계(method quantification limits, MQL), 결 정 한계(decision limit, CC_α), 검출 성능(detection capability, CC_β) 등을 확인하였다(Table 4).

Table 4. Comparison of analytical method validations for the 21 selected antibiotics according to original sample matrixes (MDL: method detection limit; MQL: method quantification limit; SW: surface water; MAN: manure; WWI: wastewater influent; WWE: wastewater effluent; SWW: swine wastewater; GW: ground water)

일반적으로 성분의 구성이 복잡한 환경 시료의 경우 LC-MS를 통해 최종 검출되는 신호의 강도가 원 시료 중 의 대상물질이 갖는 신호의 세기보다 약하거나 혹은 강해 지는 매트릭스 효과(matrix effect)를 나타낼 수 있다(^{Gros et al., 2013}; ^{Zhou et al., 2012}). ^{Seifrtova et al. (2009)}는 항생제 분석에 있어서 매트릭스 효과를 나타내는 인자로 세 가지를 제시하였는데 원치 않는 물질이 검출되면서 크로마 토그램의 바탕선(baseline)이 상승하여 분석대상물질의 피크 검출을 방해하는 경우가 있다고 하였다. 또한 시료중의 유 기물질에 항생제가 흡착되어 전처리 효율(추출 및 농축)이 감소되거나, 함께 추출된 물질들이 이온화과정에서 분석대 상물질의 이온화 효율을 감소시킬 수 있는데 이러한 경우 분석 값이 실제보다 낮게 측정되거나 검출되지 않는 현상이 나타나기도 하였다(^{Gros et al., 2006}; ^{Kasprzyk-Horden et al., 2007}; ^{Vanderford et al., 2003}). 추출/분석 중 발생하는 손실과 오차를 보정하여 정량과 회수율의 정확성을 높이기 위한 방법으로 matrix-matched calibration과 내부표준물질 (internal standard)을 사용하여 검량 곡선을 작성하는 방법이 주로 사용되고 있다(Bousova et al., 2013). Matrix-matched calibration은 분석 대상 시료와 유사한 매트릭스를 갖는 바 탕시료를 표준용액 제조 시 용매로 사용하는 방법으로 표 준용액 제조 용매와 시료의 매트릭스 차이로 인해 발생하 는 오차를 최소화할 수 있으나 환경시료와 유사한 매트릭 스를 갖는 바탕시료를 얻기 어려운 단점을 가지고 있다. 이러한 경우 내부표준물질을 사용하며 내부표준물질과 분 석 대상물질의 농도비와 피크 면적비를 사용하여 검량 곡 선을 작성한다. 내부표준물질은 분석을 수행하는 전 과정에 서 분석대상물질의 특성을 반영할 수 있도록 유사한 화학 구조를 갖는 물질을 선택해야 하며 일반적으로 질소나 탄 소의 동위원소 또는 중수소로 치환된 물질이 사용된다(^{Ho et al., 2014}; ^{Yang et al., 2010}).

조사된 문헌들은 동물의 근육, 우유, 계란, 지표수, 하수, 분뇨 등 다양한 시료를 대상으로 하고 있으며 검정 곡선의 범위는 0에서 수천 μg/L (μg/kg) 사이를 사용하는 것으로 나타났다. ^{Vucicevic-Prcetic et al. (2011)}은 아미노글리코사 이드 계열 의약품의 순도를 측정할 목적으로 고농도 범위 에 적용 가능한 분석방법을 개발하기도 하였는데, 최대 164,000 μg/L 의 농도를 갖는 표준용액을 사용하여 검정곡 선을 작성하기도 하였다. 검정곡선의 직선성을 검증하기 위 해 r² 값을 검토하였고 대부분의 검정선은 0.990 이상의 값 을 갖는 것으로 나타났으나 ^{Lopes et al. (2012)}와 ^{Nebot et al. (2012)}은 r²>0.98의 검량선으로 잔류농도를 측정하였다.

분석방법의 정확도를 평가하기 위해 분석과정 전체의 회 수율을 검토하기도 하지만 환경시료 분석과 같이 전처리가 중요시 되는 분석 과정에서는 전처리 방법의 효율을 평가 하기 위한 목적으로 회수율을 사용하기도 한다. 전처리 전 과 후에 특정 농도의 표준용액을 투입한 두 시료에서 표준 물질의 농도를 측정하고 전처리 과정에서 회수되는 비율을 계산한다. 대부분의 방법에서 60~120% 범위의 회수율을 나타내고 있으나 퇴비와 같은 매우 복잡한 매질에서(^{Zhou et al., 2012})나 pH에 의해 영향을 받는 베타 락탐계열의 항생제 등은 50% 이하의 회수율(^{Gros et al., 2013})을 나타 내기도 하는 것으로 알려져 있다.

LOD와 LOQ는 분석 장비, 분석 방법 분석자의 숙련도에 따라 그 값이 달라질 수 있기 때문에 특정 분석방법에 대 한 한계 값들을 방법검출한계(MDL)와 방법정량한계(MQL) 로 구분하여 나타내기도 한다. 특히, 환경시료와 같이 복잡 한 시료의 경우, 전처리 방법에 따라 그 한계값이 변하는 경우가 많아 분석 장비에 표준용액을 직접 주입하여 측정 하는 장비검출한계(instrument detection limit, IDL)와 장비 정량한계(instrument quantification limit, IQL)를 구분하여 평가하기도 한다(^{Ho et al., 2012}; ^{Iglesias et al., 2012}).

대상 항생제를 분석한 문헌을 조사한 결과 1 ng/L (ng/g) 이상에서 수백 ng/L (ng/g)의 MDL과 1 ng/L에서 최대 2,000 ng/L의 MQL을 갖는 것으로 나타났다. 그러나 대부분의 방 법들은 수십 ng/L이하의 정량한계를 나타내고 있고, 이는 ppt 수준으로 환경 중에 존재하는 미량농도의 잔류항생제 를 분석하기에 충분한 정량한계를 가지는 것으로 판단된다.

일부 문헌들은 LOD와 LOQ 대신 CC_α, CC_β값을 계산하 여 분석방법을 검증하기도 하였다(^{Nebot et al., 2012}; ^{Tao et al., 2012a}; ^{Zhu et al., 2008}). 유럽연합 집행위원회(European Commission)는 최대잔류허용량(maximum residue limit, MRL) 을 가지는 의약물질의 분석방법에 대한 신뢰도를 높이고 검증 기준 지침을 통해 CC_α, CC_β를 포함한 검증 기준들에 대한 계산 방법을 제시하고 있다(^{EU Commission, 2002}). 최대잔류허용량이 제시된 경우, CC_α는 최대잔류 허용농도 로 첨가(fortified)된 시료 20 개의 농도를 측정하고 최대 잔류허용량에 표준편차 값의 1.64배를 더하여 계산하며 이 값을 최대잔류허용량 초과여부를 판단하는 기준으로 한다 (95% 신뢰수준). CC_β는 CC_α농도로 첨가된 시료 20개의 농 도를 측정하고 표준편차 값의 1.64배를 CC_α에 더하여 계산 하며 이 값은 분석 대상 물질의 정량 가능한 최저농도이다 (95% 신뢰수준). EU, 중국, 일본 등은 본 연구에서 대상 항생제로 선정한 물질들 중 아미노글리코사이드 계열의 항 생제 일부에 대해 최대잔류허용기준을 가지고 있어 아미노 글리코사이드 계열의 항생제에 대한 연구 문헌들은 CC_α, CC_β값으로 분석 방법을 검증하고 있으며(^{Tao et al., 2012}; ^{van Holthoon et al., 2009}; ^{Zhu et al., 2008}) 항생제의 종류 에 따른 기준 농도의 차이로 인해 수십~수천 ng/g의 CC_α, CC_β값을 갖는 것으로 조사되었다(Table 4). 우리나라 또한 아미노글리코사이드계 항생제에 대한 최대잔류허용량 기준 이 존재하나 CC_α, CC_β를 통해 분석방법을 검증한 논문은 보고된 바 없으며 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계 등을 통한 검증을 수행하는 것으로 조사되었다(^{Cho et al., 2014}; ^{Lim et al., 2012}).