2.1. 시료 채수 및 균주 분리

연구에 사용된 균주는 2016년 5월부터 12월까지 낙동강 표층수를 채수하여 분리하였으며, 현장시료에서 분리된 균 주의 자원 번호(strain number)를 붙여 관리하였다. 시료 분 석은 광학현미경(ECLIPSE 80i, Nikon, Japan)을 이용하여 정확한 동정을 실시하고 사진촬영 하였으며, 촬영된 사진은 이미지 분석 프로그램(NIS-Elements F 3.0 software, Nikon, Japan)을 통해 세포의 길이와 크기를 분석하였다. 종의 형 태적 분류는 ^{Komárek and Anagnostidis (2005)}과 ^{Komárek (2013)}을 참고하였다. 현장시료를 통해 분리된 총 8개의 균 주는 선행연구(^{Ryu, 2017}; ^{Ryu et al., 2017}; ^{Ryu et al., 2018})를 통하여 형태학적으로 다음의 7개의 종으로 동정되 었다(Table 1, Fig. 1). Aphanizomenon flos-aquae Ralfs ex Bornet et Flahault 1888, Planktothrix agardhii (Gomont) Anagnostidis et Komárek 1988, Geitlerinema amphibium (Agardh ex Gomont) Anagnostidis 1989, Pseudanabaena mucicola (Naumann et Huber-Pestalozzi) Schwabe 1964, Dolichospermum plankctonicum (Brunnthaler) Wacklin et al., 2009, Dolichospermum crassum (Lemmermann) Wacklin et al., 2009, Pseudanabaena westiana Anagnostidis 2001.

Fig. 1. Photographs of the strains isolated in Nakdong River. Akinetes and heterocytes are indicated with white and black arrows respectively. (a)Dolichospermum planctonicum, (b)D. crassum, (c)Aphanizomenon flos-aquae, (d)Planktothrix agardhii, (e)Geitlerinema amphibium, (f)Pseudanabaena westianam, (g)P. mucicola.

현장시료로부터 사상형 남조류의 균주를 분리하기 위해, 도립 현미경(DMi1, Leica, German) 400배 하에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균된 CB 배지(^{Shirai et al., 1989})가 담 긴 well cell culture plate로 옮겨졌으며, 이 과정을 single trichome이 분리될 때까지 반복하여 수행하였다. 분리된 균 주는 150 ml 배지가 담긴 250-ml Erlenmeyer flask에 담아 진탕배양기(HB-201SLI, Hanbaek, Korea)에서 다음 조건으 로 배양되었다; 25 °C의 온도, 80 μmol s^-1 m^-1의 백열등 광 조건(L : D = 12 h : 12 h).

Geosmin 생성 여부를 결정하기 위해서 배양 실험은 초기 농도를 약 2.0 × 10⁵ cells mL^-1가 되도록 접종하였으며, 회분 식 배양법으로 28일간 유지하였다. Geosmin 생성이 확인된 균주는 멸균된 CB medium이 담긴 250 mL Erlenmeyer flask에 전배양(pre-culture)으로 대수증식기(exponential growth phase)에 도달한 약 2.0 × 10⁵ cells mL^-1의 세포를 초기 농도 로 접종하여 회분식 배양법으로 진행하였다.

2.2. DNA 추출 및 PCR 증폭

배양된 균주는 대수증식기(exponential growth phase)까지 유지되었으며, 원심분리를 통해 배양액과 균주를 분리하여 실험에 사용하였다(14,000×g, 1 min). DNA는 LaboPass™ Tissue Mini (Cosmogenetech, Korea)를 사용하여 추출하였다.

PCR 반응 용액의 조성은 1.0 μL의 DNA template, 3 μL 의 10× TaKaRa Ex Taq buffer, 2.4 μL의 dNTP (10 mM), 0.5 μL의 primer (10 pmol), 0.2 μL의 TaKaRa Ex Taq polymerase (5 Unit μL^-1, TaKaRa, Ohtsu, Japan)로 구성하였으며, 전체 용량이 30 μL가 되도록 하였다. geoA유전자는 primer geo78F (^{Suurnäkki et al., 2015}), geo971R (^{Giglio et al., 2008}), geo982R (^{Suurnäkki et al., 2015})을 이용하여 증폭하 였으며(Table 2), geo78F/geo982R primer 조합은 남조류에서 geoA 유전자의 보존적 부위 905 bp를 증폭하며, Planktothrix, Cylindrospermum, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nostoc, Calothrix 등 다양한 분류군의 균주를 대상으로 geosmin 생 산자를 검출할 수 있다(^{Suurnäkki et al., 2015}). PCR 조건 은 초기 변성단계인 94 °C에서 2분간 1회 처리 한 후 DNA 변성단계인 94 °C에서 30초, primer 풀림단계인 55 °C에서 30초, strand 신장 단계인 72 °C에서 5분간 진행하여 총 30 회 반복하였으며, 최종 신장 단계는 72 °C에서 5분간 처리 하였다.

증폭된 PCR 산물은 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 정제하였으며, 염기서열 결정을 위해 서 Macrogen (Seoul, Korea)에 분석을 의뢰하였다.

geoA의 염기서열 분석 및 계통수 작성

2.3.

계통학적 분석을 위하여 forward와 reverse 방향의 각 염기 서열들은 Vector NTI Advance 11 (Invitrogen Corp., USA)로 조합하였다. 분류학적 위치를 확인하기 위하여, 유전자 은 행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 염기서열이 등록된 분류군을 선별하였다. 정렬된 염기서열은 MEGA 5.2 (^{Tamura et al., 2011})을 이용하여 Maximum likelihood (ML)와 Maximum parsimony (MP), Neighbor-joining (NJ) 방법으로 계통수를 작성하였고, 염기 치환 모델은 Tamura-Nei와 Subtree-prunning-regrafting (SPR) algorithm, Maximum composite Likelihood가 각각 사용되 었다. 각 분계도의 지지정도를 알아보기 위해 1,000회 반복 하여 bootstrap을 산출하였다.

본 연구에 사용된 primer가 사상형 남조류에 대하여 종특이 적임을 검토하기 위해, 본 연구에 사용된 primer를 바탕으로 NCBI 데이터베이스에서 이용가능한 남조류(Cyanophyceae), 고세균(Proteobacteria), 방선균(Actinobacteria) 생산자에 대 한 Primer-Blast 분석을 실시하였다.

2.4. 이취미 물질(geosmin) 분석

Geosmin 생성여부를 결정하기 위한 시료는 각 균주별로 28일간 회분식 배양이 끝난 조체와 배지가 포함된 배양액 을 대상으로 실시하였으며, 각 성장단계별 geosmin 생산량 분석은 4일 간격으로 조체와 배지가 포함된 배양액을 대상 으로 수행하였다.

Geosmin 분석은 먹는물 수질감시항목지침(^{ME, 2011})에 따라 GC-MS (7890A, Agilent, USA)를 이용하여 HS-SPME (Head Space–Solid Phase MicroExtraction)법으로 분석하 였다. 본 추출법은 fiber를 이용하여 분석 대상물질을 선택 적으로 흡착시킨 후 분석하는 방법으로써 휘발성 유기화합 물질의 미량 분석에 주로 이용되는 방법이다(^{Chae et al., 2017}). 본 연구에서 지오스민의 분석을 위해 사용한 실험조 건은 아래와 같다; Column (30 m length × 0.25 mm inside diameter × 0.25 μm film thickness), retention time (7.58 ± 0.01 min), Full scan electron impact mass spectra (50 ~ 200 m/z). geosmin의 정량 분석은 크로마토그램에서 retention time에 해당하는 위치의 peak의 면적을 구한 후, 절대 검정 곡선법을 적용하였다. 절대검정곡선은 정제수 10 mL에 표 준혼합용액(SUPELCO, German)을 0.005 ~ 0.2 μg L^-1까지 단 계적으로 첨가하여 각 분석화합물의 농도(μg L^-1)와 각 분 석화합물에 해당하는 peak 면적을 통해 작성하였다.

3.1. 유전학적 분석법을 이용한 geosmin 생성능 분석

낙동강에서 분리된 균주들의 이취미(geosmin)의 잠재적 생성능을 확인하기 위하여 사용된 geosmin synthase 유전자 인 geoA는 geosmin 생성여부를 결정하는 molecular marker 로서 이취미를 생성하지 않는 균주에서는 발견되지 않는다 (^{Suurnäkki et al., 2015}; ^{Wang et al., 2015}). geoA 유전자 가 포함된 geo gene cluster는 총 2,256 bp의 크기이며, 두 개의 cyclic nucleotid-binding (cnb) 유전자와 인접한 전사 단위에 위치하고 있다(Fig. 2).

Fig. 2. Gene cluster responsible for the synthesis of geosmin in two strains ofD. ucrainicum. Upper: strain CHAB 1432; Lower: strain CHAB 2155 (afterWang et al., 2015).

낙동강 현장시료에서 분리된 8개 균주 중 목표 유전자인 geoA 유전자가 DGUC006, DGUC012에서 각각 826 bp와 766 bp의 길이로 증폭되었으며, 766 bp로 정렬되었다. 사 용된 primer는 두 개 균주에서 모두 반응하였으나, geo78F/ geo982R primer 조합의 서열화 산물이 크로마토그램 분석에 서 보다 명확하였다. target gene의 염기서열을 NCBI 유전자 은행에서 BLAST 한 결과, Anabaena ucrainicum CHAB1432 (Accession no.: HQ404996)와 100 %, Dolichospermum planctonicum CHAB3501 (Accession no.: KM013400)와 99.7%, Dolichosepermum ucrainicum UOM59 (Accession no.: MF996872)와 99.5 %의 상동성을 보였다(Table 3). 이를 통하여 낙동강에 서 분리된 7개 속의 균주들 중 Dolcihspermum planctonicum 만이 geosmin의 생합성 여부를 결정하는 목표 유전자(target gene)를 가지고 있는 것으로 분석되었다(Table 4). 두 개 균 주의 유전자 정보는 유전자은행 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)에 등록되었으며, MF807215, MF807216의 Accession no.을 각각 부여받았다. 낙동강 수 계에서 출현하는 남조류를 대상으로 geosmin 생성 유전자 검출에 대한 연구는 최초로 수행되었다.

고세균(proteobacteria), 방선균(Actinobacteria), 남조류(Cyanophyceae) 의 geoA 유전자를 바탕으로 계통분석을 실시한 결과, 남조류의 geo synthase gene가 하나의 cluster로 그룹 화되는 반면, 방선균 및 고세균의 cluster와는 뚜렷하게 분 리되는 형태를 보였다. 특히 고세균으로부터 추정된 geoA 의 염기서열이 방선균으로부터 분리된 것보다 계통학적으 로 남세균에 더 가까운 것으로 확인되었으며(Fig. 3), 이러 한 특징은 선행연구에서도 유사하게 확인되었다(^{Suurnäkki et al., 2015}). 일반적으로 고세균은 geosmin과 2-MIB와 같 은 이취미 물질을 생산하는 것으로 알려져 있지만, 이에 대 한 연구는 매우 제한적이다(^{Dickschat et al., 2005}; ^{Dickschat et al., 2007}).

Fig. 3. Maximum likelihood tree based on the sequences of putative geosmin synthase from cyanobacteria, proteobacteria and actinobacteria. The strains of study are marked by shading. Numbers at the nodes are levels of bootstrap support. Scale bar indicates 5% sequence divergence. Cluster I and Cluster II denote Order Oscillatoriales and Order Nostocales, respectively.

한편 Primer-BLAST 분석을 통해, 본 연구에 사용된 primer 가 오직 geosmin 생성자인 남조류 유전자 서열만 증폭하는 것을 확인하였으며, 계통분석에 사용된 고세균과 방선균 등 의 geosmin synthase 유전자 서열은 인식하지 못하였다.

본 연구에 사용된 2개 균주(DGUC006, DGUC012)와 NCBI 에 등록된 Dolichospermum 속들은 단일 cluster로 다른 남 조류와 99 ~ 100 %의 bootstrap value로 분지가 지지되었다. 반면, 이형세포를 가지는 사상형 남조류와 이형세포를 가지 지 않는 사상형 남조류는 계통학적으로 뚜렷하게 분리되지 않았는데, 이러한 특징은 16s rRNA 유전자 기반의 계통수 에 의해 밝혀진 내용과는 차이를 보였다(^{Wang et al., 2015}).

3.2. 화학적 분석법을 이용한 geosmin 생성능 분석

낙동강에서 분리된 8개 중 2개 균주(strain no.: DGUC002, DGUC006)에서만 geosmin이 최고 농도 17,535 ng L^-1로 검 출되었으며, 이들 균주는 모두 Dolichospermum plantonicum 으로 확인되었다. 2개 균주의 배양액에서 geosmin의 검출 농 도는 최초접종 4일 이후에 평균11 ng L^-1로 확인되었으며, 이 후 배양시작 24일차까지 빠르게 증가하는 양상을 보였으나, 28일에 다소 감소하였다(Fig. 4). 그 밖에 Aphanizomenon속 및 Planktothrix속, Pseudanabaena속은 이취미를 생성하는 분류군으로 보고되고 있으나(^{Acinas et al., 2009}; ^{Izaguirre and Taylor, 2004}; ^{Suurnäkki et al., 2015}; ^{Zhang et al., 2009}), 낙동강에서 분리된 분류군에서는 geosmin이 생성되지 않았다. 특히 Microcystis 속의 군체에서 분리한 Pseudanabaena westiana (strain no.: DGUC013)에서도 배양기간 동안 geosmin 이 생성되지 않았다. Microcystis에 의한 녹조 현상에서 발 생하는 이취미의 기원은 Microcystis 군체 내에 공존하는 Pseudanabaena일 것으로 예상하였으나, Pseudanabaena 단 일 세포 배양을 통한 본 실험의 결과는 이와 상이하였다. ^{Suurnäkki et al. (2015)}는 다른 유기체와의 상호 작용에 의 한 2차 대사산물의 생성 가능성을 제시하였으며, 이러한 가능성에 대한 이해는 공존 배양 실험이 필수적이다. 향후 Microcystis속과 Pseudanabaena속의 추가적인 배양 실험이 필요할 것으로 판단되었다.

Fig. 4. Changes of cell growth and geosmin production inDolichospermum plactonicum(strain no.: DGUC006) strain culture. The curve graph represents a mean value of cell densities and vertical bars represent standard deviation. The bar graphs represent a mean value of geosmin concentraion.

한편, 동일 Dolichospermum속의 D. planctonicum은 geosmin을 생성하였으나, D. crassum은 geosmin을 생성하 지 않았다(Table 3). 선행 연구를 통해, geosmin 생성종으 로 확인된 분류군은 국내 수계에서 Anabaena circinalis가, 국외 수계에서 D. flos-aquae, D. laxum, D. lemmermannii, D. ucrainicum이 각각 조사되었다(^{Giglio et al., 2008}; ^{Kutovaya and Watson, 2014}; ^{Park et al., 2017}). 이러한 결 과는 2차 대사산물이 종특이적임(species specificity)을 확인 한 선행연구와 일치하였다(^{Kakimoto et al., 2014}).

국내 먹는물감시기준인 20 ng L^-1에 기초하여, 낙동강에서 Dolichospermum planctonicum의 geosmin 최대 생산량은 평 균 2.8 × 10^-5 ng cell^-1로, 세포수가 7.1 × 10² cells mL^-1 이상 일 때 이취미 문제가 발생할 우려가 있는 것으로 확인되었 다. 중국 Dianchi와 Erhai호에서 분리된 Anabaena ucrainica 균주들의 geosmin 최대 생산량은 평균 2.4 × 10^-5 ng cell^-1로 8.3 × 10² cells mL^-1 이상일 때, 이취미 문제를 유발할 수 있 는 것으로 조사되어 본 연구와 유사한 경향을 보였다(^{Wang et al., 2015}). 반면, 국내 팔당호에서 분리된 Anabaena circinalis의 geosmin 최대 생산량은 약 18.8 × 10^-5 ng cell^-1 로 6배 높게 나타났다(^{Park et al., 2017}). 이취미의 발생량 은 세포 농도뿐만 아니라, 효소활성 혹은 유전자 발현 수 준 등의 요인에 의해서 변화될 수 있으며(^{Kakimoto et al., 2014}), 특히 다양한 생육환경 및 성장단계에 따라 변화한다 (^{Kim et al., 2015}; ^{Park et al., 2017}).

결과적으로 geosmin 발생 예측에 대한 연구는 종 수준의 분리된 균주를 이용하여 다양한 환경조건에서의 연구결과 가 축적될 때, 보다 정밀한 정량적 예측이 가능할 것으로 판단되었다.