2.1.1 박테리아 분리

생체광물 형성 최적화 미생물을 발굴하고자 시료(흙, 메주 가루 등)에서 미생물을 분리 및 배양하였다. 시료를 0.1M Tris-HCl pH 9.0 buffer 100 ml에 녹이고, 1시간 동안 상온에서 200rpm 조건으로 진탕배양을 진행했다. 배양 후 배양액 내의 이물질을 20-30분 동안 가라앉히고, 상층액을 내생포자를 형성하는 Bacillus를 분리하기 위해 끓는 물에 10분간 중탕하였다. 상층액을 증류수에 희석하여 고체배지에 도말 하여 30℃에서 배양한다. 형성된 박테리아 colony를 선별하여 Fig. 2와 같이 각각 고체배지에 30℃에서 2일간 계대배양하였다.

Fig. 2 Bacteria isolated from the sample

2.1.2 미생물의 탄산칼슘 형성 확인 및 urease test

분리한 박테리아들은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Bacillus 속 균주들만 선별하였다. 시료에서 분리한 Bacillus 6종과 비교를 위해 탄산칼슘 형성 확인된 b. subtilis와 b. sphaericus KCTC3346 2종을 포함하여 총 8개의 균주를 대상으로 실험을 진행하였고, 실험 대상의 균주들은 구별을 위해 MCE01 ~ 07까지 번호를 부여하였다(Table 1).

균주 8종을 대상으로 탄산칼슘 형성을 확인하기 위해 Urea-CaCl₂ agar(Table 2, ^{Kim, 2010)} 에 접종하여 30℃에서 배양하였다. 이 배지는 미생물 방해석 석출 작용(MICP)이 미생물의 대사(metabolism)과 함께 발생하면서 세포막 주변으로 탄산칼슘의 일종인 방해석(Calcite)이 석출된다.

24시간 간격으로 5 ~ 10일간 미생물의 탄산칼슘 형성을 관찰하였다. Fig. 3을 보면 탄산칼슘은 colony의 경계선에서 형성이 시작되어 colony를 주변을 모두 덮은 형태로 나타났다. 탄산칼슘의 생성 속도는 미생물 간 다소 차이가 존재하였다.

탄산칼슘 형성이 확인된 균주들은 urease test agar에 접종하여 30℃에서 배양하였다(Fig. 4). Urease test 양성 균주는 urea 분해로 생성된 암모니아로 인해 pH가 상승하여 배지가 붉은색으로 변한다.

Fig. 3 Bacterial colony

Fig. 4 Urease test

2.1.3 미생물의 탄산칼슘 석출량 정량

Bacillus 8종을 각각 CaCo₃ precipitation broth 100 ml (Table 3)에 30℃, 200rpm의 조건으로 60시간 배양하였다. Urea는 urease test가 양성이 나온 균주의 배지에만 첨가한다.

60시간이 경과 되면 배양액을 원심분리(1min, 13000g)하였고, 침전물을 TE buffer(10mM Tris - 1mM EDTA, pH 8.5 ) 50 ml에 풀어준 후 Lysozyme을 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. Lysozyme 처리가 끝난 배양액을 원심분리(1min, 13000g)를 한 후, 멸균된 증류수로 침전물을 풀어준 뒤 다시 원심분리하는 방식으로 세척하였다. Lysozyme으로 인해 분해된 미생물 잔해물들은 가볍기에 상층액 내에서 부유하지만 무거운 탄산칼슘은 침전물이 되어 가라앉게 된다. 이 침전물을 건조한 후 미세저울로 무게를 측정하여 탄산칼슘 석출량을 정량화하였다(Table 4).

2.1.4 미생물에 의한 탄산칼슘 XRD 분석

탄산칼슘 석출 정량 실험에서 확보한 샘플은 X-ray diffraction (XRD) 분석 통해 결정구조를 확인하였다. 실험에서 사용할 균주는 탄산칼슘 석출량이 비교적 많은 B. velezensis MCE03, B. subtilis MCE05를 채택하여 분석하였다.

Fig. 5와 Fig. 6에서 보이는 바와 같이 미생물에 의해 석출된 탄산칼슘 샘플(주황색 피크)과 탄산칼슘의 일종인 방해석(Calcite, 파랑색 피크)를 비교하면 대부분 일치한 것을 확인할 수 있다.

Fig. 5 XRD of Bacillus velezensis MCE05

Fig. 6 XRD of Bacillus subtilis MCE05

2.1.5 탄산칼슘 형성 박테리아 단일배양 복합배양 비교

MCE03, MCE05의 단일배양 및 복합배양 비교를 위해 control(미접종 배지), MCE03, MCE05, MCE03+05 총 4개의 그룹으로 나누어서 CaCo₃ precipitation broth 100 ml에 30℃, 200rpm의 조건으로 60시간 동안 배양하였다. 12시간 간격으로 배양액 10 ml를 채취하여 탄산칼슘 형성량, pH, OD600을 측정하였고, Fig. 7과 같이 그래프로 나타내어 각 실험군의 차이를 비교하였다.

알칼리성을 띠는 탄산칼슘이 생성됨에 따라 평균적으로 pH가 1 정도 높아지는 경향을 보이며, OD600과 탄산칼슘 생성량에 있어서 단일배양과 복합배양의 경우, 그 차이가 그리 크지 않은 것으로 나타났다.

Fig. 7 Time interval change of pH, OD600, amount of CaCo3precipitation

2.2.1 탄산칼슘 형성 미생물 콘크리트 환경 생존력 테스트

탄산칼슘 형성 미생물의 시멘트 환경에서 생존 여부를 검증하고자 시멘트 페이스트상 생존 실험을 진행하였다. Table 5에 보이는 바와 같이 MCE03, MCE05의 내생포자를 시멘트 페이스트 제작 시 첨가하였다.

시멘트 페이스트가 경화한 후 24시간 간격으로 시멘트 일부를 채취하여 위상차 현미경으로 관찰하였고, 이 샘플은 고체배지에 접종하여 30℃ 조건에서 배양하였다. Fig. 8에 보이는 바와 같이 시멘트 페이스트에 첨가된 포자들이 시멘트가 경화한 후 생존함을 확인하였다. 고체배지에 배양하였을 때 Fig. 9와 같이 colony를 형성하는 결과로부터 MCE03, MCE05의 포자가 시멘트 내부의 극한 환경 속에서도 생존할 수 있음을 확인할 수 있다.

Fig. 8 Vegetative cell and endospore in cement

Fig. 9 Colony from culturing in cement

2.2.2 탄산칼슘 형성 미생물 모르타르 내 균열 치유 검증

시멘트 내부에서 생존력이 확인된 MCE03, MCE05은 모르타르 제작에 첨가하여 균열 치유 효과를 평가하였다. 물:시멘트:모래 비율을 1:2:3으로 맞추고, CaCl₂와 Yeast extract의 비율을 시멘트 중량의 1% 그리고 0.055%로 첨가하였다^{(Xu, 2014)}. 모르타르 구성 성분은 Table 6과 같다.

모르타르를 96시간 동안 상온에서 굳힌 후 균열을 발생시켰고, 증류수를 1cm 높이로 하단 침지하여 상온에서 배양하였다. 배양 후 48시간이 되는 시점에서 흰색의 탄산칼슘 형성을 관찰할 수 있었다. 치유된 균열은 Fig. 10과 같이 현미경을 이용하여 50배율로 관찰하였다.

Fig. 10 Self-healing of mortar by bacteria