2.1 바이오매스 배양과 그래뉼 농축

본 연구에서 사용된 anammox 슬러지는 대구광역시 서부 하수처리장에 위치한 파일럿 규모 반응기로부터 접종되었다. 해당 반응기는 sidestream 하수를 처리하기 위해 부분 아질산화조 및 anammox조로 구성된 two-stage 공정으로 운영되었다. 채집된 anammox 슬러지는 가로 17 cm, 세로 100 cm, 총 부피 22 L의 실험실 규모 상향류식 expanded granular sludge bed reactor (EGSB)에 접종되었다. 반응기는 아크릴로 제작되었으며, 완전히 밀봉되어 혐기성 조건을 유지하였다. 유입수는 반응기 하부에서 주입되었으며, 유출수는 EGSB의 상단에서 배출되었다. 교반속도는 그래뉼의 파손을 방지하고 생성된 N₂ 가스를 그래뉼에서 원활히 제거할 수 있도록 14 rpm으로 설정하였다. 침전 선택압으로 인해 밀도가 높고 부피가 큰 AGs는 EGSB 내부에 유지된 반면, 저밀도의 부유 anammox 슬러지는 유실되었다. 본 실험의 반응기는 continuous stirred-tank reactor (CSTR)로 구성되었으며, anammox 미생물 배양에 최적인 37 °C로 설정되었다. 반응기에 유입된 합성 폐수의 조성은 NH₄Cl; 40–308 mg-NH₄⁺-N/L, NaNO₂; 54-337 mg-NO₂^--N/L, NaHCO₃; 95 mg-HCO₃^--C/L, KH₂PO₄; 6 mg-PO₄^--P/L, MgSO₄⋅7H₂O; 12 mg-Mg²⁺/L, CaCl₂⋅2H₂O; 48 mg-Ca²⁺/L, Trace Ⅰ, Trace Ⅱ는 각각 1 mL/L씩 투여되었다. Trace의 조성은 ^{Park et al. (2024)}의 연구를 참고하였다. 또한, EGSB 반응기에 접종된 anammox 미생물 초기 volatile suspended solid (VSS) 농도는 5,600 mg/L이었다.

2.2 IP-IAGs 제작 조건 최적화

AGs의 침전성을 개선하기 위해 철 입자를 첨가한 IP-IAGs와 기존 AGs의 비교실험을 진행하였다. ^{Chen, Zhang et al. (2021)}의 연구에 따르면, 20 μm 이하 크기의 magnetite는 anammox 미생물과 높은 결합력을 가지는 것으로 보고되었으며, ^{Zhang, Wang et al. (2022)}은 43 μm 크기의 ZVI와 anammox 미생물을 결합한 공정에 대한 연구를 진행하였다. 이러한 선행 연구를 바탕으로, 본 연구에서는 53 μm 체를 통해 53 μm 이하 크기의 철 입자(Hands Korea, Republic of Korea)를 선별하였다. 철 입자의 결정구조를 파악하기 위해 magnetite와 철 입자에 대해 X-선 회절 분석법(X-ray diffraction, XRD)을 실시하였으며, 분석 결과는 Fig. 1에 제시하였다. XRD 분석 결과, 철 입자가 높은 비중을 가지고 있어 그래뉼의 밀도를 효과적으로 증가시킬 수 있음을 확인하였으며, 이에 따라 철 입자가 사용되었다. 철 입자 함입 결과, IP-IAGs는 평균 직경이 AGs보다 7.41% 작았음에도 불구하고 침전성이 17.91% 개선되었음을 확인했다(^{Park et al., 2024}). 이후, 철 입자의 광물 조성을 분석하기 위해 주사 전자 현미경-에너지 분산형 X-선 분광법(Scanning Electron Microscope-Energy Dispersive X-ray Spectroscopy, SEM-EDS)을 수행했다. SEM-EDS 분석 결과, 철 입자의 조성은 Fe 59.9wt%, O 22.5wt%, C 13.9wt%, Si 3.1wt%, Ca 0.6wt%으로 조성된 것으로 확인되었으며, ^{Park et al. (2024)}의 연구에서 최적화된 철 입자 투여량을 바탕으로 AGs 1mg 당 0.75 mg의 철입자가 투여되었다.

Fig. 1. Analysis with XRD (a) iron particles (b) magnetite.

EGSB에서 균질한 혼합은 미생물 유실을 유발하여 질소 제거 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 이를 해결하기 위해 본 연구에서는 반응기 내부에 아크릴판을 설치하여 미생물 침전을 위한 별도의 공간을 설계하였다. 본 연구에서 사용된 반응기는 4 L의 혼합구역과 1 L의 침전 구역으로 구성되어 총 유효 부피는 5 L로 설계되었다. 침전 구역에는 밑면으로부터 60°로 기울어진 경사판이 설치되었으며, 폐수는 혼합구역 상부에서 유입되어 침전 구역의 28.5 cm 높이 상부에서 배출되도록 설계되었다. 교반은 상부에 설치된 임펠러를 통해 50 rpm으로 이루어졌으며, 반응기 온도는 열선과 자동 온도 조절기(MTOPS, TC130P, Republic of Korea)를 사용하여 37 °C로 유지하였다.

반응기는 두 가지 단계로 나누어 39 d 동안 운영되었으며, 이 기간 동안 NLR을 점진적으로 증가시켰다. 반응기에서 배양된 AGs 및 IP-IAGs의 초기 VSS 농도는 3,133 mg/L이며, 유입된 합성 폐수는 NH₄⁺와 NO₂^-의 몰비를 1:1.32로 유지하였다. 반응기 운영은 Phase 1과 Phase 2로 진행되었으며 Phase 1 (1–30 d) 동안 수리학적 체류시간(hydraulic retention time, HRT)은 24 h으로 일정하게 유지되었고, 총질소(total nitrogen, TN) 농도는 95 mg-N/L에서 464 mg-N/L로 점진적으로 증가시키며 유입수의 pH는 7.6–8.1의 범위로 유지했다. Phase 2 (31–39 d)는 stress test를 위해 TN 농도를 696 mg-N/L로 증가시키고, HRT를 8.5 h까지 서서히 감소시켰다. HRT의 감소로 인해 NLR은 1.82 kg-N/m³⋅d까지 증가하였으며, Phase 1에 비해 약 4배 이상의 NLR이 AGs와 IP-IAGs에 작용하였다. 이를 통해 stress 환경에서의 anammox 활성에 대한 비교분석을 수행하였다.

2.3 미생물 군집구조 분석

본 연구에서는 철 입자 유무에 따른 anammox 공정의 효율과 군집의 변화 및 특성을 확인하기 위해 AGs, IP-IAGs, RW-PN, RW-IAGs의 샘플을 채취하여 미생물 군집구조를 분석했다. 미생물 샘플링은 각 anammox 공정에서 안정적인 질소 처리 효율이 측정된 시점에서 진행되었다. 미생물 군집구조 분석을 위해 DNA Extraction kit (FastDNA SPIN Kit for soil. MP Biomedicals, USA)와 FastPrep-24 (MP Biomedicals, USA)를 사용하여 샘플의 genomic DNA를 추출하였다. 샘플은 Sodium Phosphate Buffer 978 μL, MT buffer 122 μL와 혼합되었으며, Fastprep 장비를 사용해 6.0 m/s에서 40초간 파쇄된 후, 원심분리를 진행하였다. 그 후 PPS 용액 250 μL을 첨가 및 혼합하여 원심분리를 통해 샘플 내 단백질을 침전시켰다. DNA binding, SPIN filtering, Washing, Air dry 단계를 거쳤으며, 최종적으로 DES Elution buffer를 70 μL를 첨가하여 원심분리를 통해 DNA Extraction을 완료하였다. FastDNA SPIN Kit for soil은 토양환경 외에도 여러 환경에서 미생물, 균류 또는 동식물의 DNA를 분리하기에 적합하다. DNA 샘플은 시퀀싱을 포함한 추가 사용이 있을 때까지 -20 °C에서 보관하였다(^{Park et al., 2022}). 추출된 DNA는 Macrogen Inc. (Republic of Korea)의 Illumina MiSeq platform (Illumina, San Diego, CA, United States)을 사용해 범용적으로 미생물 증폭에 사용되는 341F/805R 영역 primer를 사용하여 16s rRNA의 V3 및 V4 영역 시퀀싱을 진행하였다. Q-score가 30점 이상인 염기의 비율은 82.68–84.32%로, 메타게놈 시퀀싱 품질이 양호한 것으로 나타났다. Paired-end read들은 Fast Length Adjustment of Short Reads (FLASH 1.2.11)를 통해 병합되었으며, 길이가 짧거나 긴 경우에는 필터링 및 트리밍과정을 거쳤다. CD-HIT-DUP 100을 사용해 같은 환경에서 두 차례 클러스터링을 수행하였으며, 2차 클러스터링을 진행하기 전에 모든 키메라 서열을 식별하고 제거하였다. 키메라 서열이 아닌 클러스터의 대표적인 read들은 greedy algorithm을 이용하여 추가 클러스터링을 거쳤으며, 3%의 distance cutoff에서 amplicon sequence variant (ASV)를 형성하였다. 그 후, Quantitative insight into Microbial Ecology (QIIME) 매개 변수를 준수하는 QIIME pipeline을 사용하였으며, Ribosomal Database Project (RDP) database를 사용하여 각 샘플에 대해 문에서 종 수준에 이르는 분류를 수행하였다. 또한, 선별된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스와 비교하여 미생물의 분류학적 정보를 도출했다.

3.1 철 입자 투입에 의한 anammox 군집 변화

바이오매스 샘플은 각 반응기에서 미생물 활성을 대변하는 질소 제거 속도(nitrogen removal rate, NRR) 값을 가질 때 1 mL씩 분취하여 샘플링되었다. EGSB 배양조의 초기 군집은 phylum 수준에서 Firmicutes (46.68%), Actinobacteria (6.26%), Proteobacteria (10.66%), Planctomycetota (5.11%), Acidobacteria (1.65%)로 구성되었으며, genus 수준에서는Carnobacterium (38.14%), Candidatus Brocadia (5%), Uncultured bacterium (3.49%), Croceifilum (2.58%), Dechloromonas (2.32%)가 관측되었다. AGs는 phase 2의 NLR 증가에 따라 활성 감소가 뚜렷하게 나타났다. 이에 따라 철 입자 함입에 따른 군집구조를 비교하기 위해 AGs는 초기 접종 배양액을 기준으로 분석을 진행하였다. IP-IAGs는 반응기 운영 기간 중 NRR이 1.54 kg-N/m³⋅d로 가장 높았던 39 d의 시료를 분석하였다.

ZVI와 Fe₃O₄로 이루어진 철 입자의 ZVI는 용존산소를 소비하며 Fe²⁺와 Fe³⁺로 산화되고, 이는 anammox 생장에 중요한 요소로 작용한다. 또한, ZVI, Fe²⁺, Fe³⁺는 anammox 생장에 중요한 요소이다. ZVI는 산화 과정을 통해 ORP를 감소시켜 anammox 미생물이 선호하는 환경을 조성한다(^{Yan et al., 2019}). ^{Van Niftrik et al. (2008)}은 anammox 미생물의 소기관인 anammoxosome이 철 성분을 포함하며, 내부 전자전달계와 관련되어 있다고 보고하였다. 또한, anammoxosome은 에너지 생성뿐만 아니라 철 성분의 저장소 역할을 수행하며 heme 함유 효소의 생성을 지원한다(^{Gao et al., 2014}; ^{van Niftrik. and Jetten, 2012}). ^{Strous et al. (2006)}은 Ca. Kuenenia stuttgartiensis에서 철분 저장 단백질로 추정되는 두 가지 bacterioferritins (Bfr) 유전자인 Q1Q5F8과 Q1Q315를 발견하였다. 이 철분 저장 단백질은 anammoxosome 내에서 철을 저장하고 방출하는 역할을 하며, anammox 반응에서 중요한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다(^{Ferousi et al., 2017}). 미생물 군집 분석 결과, Planctomycetota의 상대 비율은 AGs에서 48.27%였으나, IP-IAGs에서는 26.72%로 감소하였다(Fig. 3). 반면, substrate loading rate (SLR)을 1.82 kg-N/m³⋅d까지 증가시킨 결과, AGs는 substrate removal rate (SRR)가 0.0063 kg-N/m³⋅d인 반면, IP-IAGs에서는 SRR이 1.54 kg-N/m³⋅d까지 상승하여 안정적인 anammox 공정이 유지되었다(Fig. 2). ^{Liu and Horn (2012)}의 연구에 따르면 유입수 내의 Fe²⁺와 Fe³⁺가 각각 1.3 mg/L, 0.4 mg/L보다 낮을 때, 질소 제거 효율이 선형적으로 증가한다고 보고되었다. 또한, Fe²⁺를 첨가한 다양한 anammox 연구에서도 Planctomycetota가 가장 우점하지는 않았지만, 질소 제거 효율이 향상되는 경향이 확인되었다(^{Shu et al., 2016}). 또한, ^{Dsane et al. (2023)}의 연구에 의하면 anammox 미생물과 magnetite가 결합됨에 따라 Planctomycetota의 종 분포는 anammox 특이적으로 수렴하였다. 이와 마찬가지로, IP-IAGs도 Planctomycetota의 우점도는 감소하였지만 anammox 군집의 우점도는 증가하여 질소 제거 효율이 증가한 것으로 추정된다.

Fig. 2. Comparative performance of IP-IAGs and AGs: (a) substrate loading rate (SLR) and substrate removal rate (SRR) of AGs; (b) SLR and SRR of IP-IAGs.

Fig. 3. Representative phyla of AGs and IP-IAGs.

더욱 세부적인 분석을 위해 상위 10개의 species에 대한 상대적 우점도를 Table 2 및 Fig. 4에 제시하였다. AGs는 anammox 미생물로 Ca. Brocadia sinica JPN1 (39.26%), Uncultured anaerobic ammonium-oxidizing bacterium (2.13%), Ca. Kuenenia sp. (1.47%)가 관측되었다. AGs는 IP-IAGs와 비교하여 Ca. Brocadia sinica JPN1의 상대적 우점도가 더 높게 나타났으나, IP-IAGs에서는 Ca. Brocadia sinica JPN1 (7.01%)외에도 Uncultured anaerobic ammonium-oxidizing bacterium (6.62%)과 Ca. Jattenia sp. (5.62%)이 확인되었다. IP-IAGs는 AGs보다 anammox 미생물 간 균등도가 더 높은 것으로 나타났다. 군집의 균등도를 나타내는 Pielou’s evenness 지표에서 AGs가 0.57을 보이는 반면, IP-IAGs에서 0.71로 더 높은 균등도를 나타냈다(Table 1). 특히, IP-IAGs에서 Ca. Jettenia의 높은 우점도는 ferrihydrite, Fe₃O₄, Fe³⁺ 등을 함유한 기존 anammox 공정에서 Ca. Kuenenia와 Ca. Brocadia가 주로 우점하며 Ca. Jettenia의 우점도가 낮았던 결과와는 상반된다(^{Liu et al., 2021}; ^{Wang, Fan et al., 2022}; ^{Wang et al., 2021}; ^{Xu et al., 2020}; ^{Zhang, Cheng et al., 2018}; ^{Zhang, Wei et al., 2022}). ^{Zhang et al. (2021)}은 Fe³⁺ 투여량을 0 mg/L에서 100 mg/L로 증가시킨 실험에서 Ca. Brocadia의 상대적 우점도가 감소하는 경향을 보고하였다. ^{Wang, Shu et al. (2016)}의 연구에서는 Fe³⁺ 농도가 6.72 mg/L일 때, Ca. Kuenenia의 우점도가 7.70%에서 4.15%로 감소한 반면, Ca. Jettenia의 우점도는 0.24%에서 0.56%로 증가하였다. ^{Ali et al. (2015)}은 Ca. Jettenia가 hydrazin synthase (hzs), hydroxylamine oxidoreductase (hao), nitrite oxidoreductase (nxr)와 같은 heme 효소를 풍부하게 포함하고 있어 세포 내 철 함량이 높다고 보고하였다. 또한, Ca. Jettenia caeni와 Ca. Brocadia sinica의 세포 내 금속 성분을 비교한 결과, Ca. Jettenia caeni가 Ca. Brocadia sinica보다 더 많은 양의 철을 포함하고 있음이 확인되었다. 이를 바탕으로, 철 입자를 함입한 IP-IAGs에서는 풍부한 철 성분으로 인해 Ca. Jettenia의 우점도가 높아진 것으로 판단된다.

Fig. 4. Representative genera and species of AGs and IP-IAGs.

3.2 Anammox 군집 공동 자생 미생물 변화

AGs에서 anammox 미생물이 속한 phylum인 Planctomycetota는 48.27%로 높은 우점도를 보였으나, IP-IAGs에서는 Planctomycetota의 우점도는 26.72%로 감소하였다. 반면, Pseudomonadota의 우점도는 AGs에서 18.49%였던 반면, IP-IAGs에서는 22.29%로 우점도가 상승하였다(Fig. 3). 생물막 기반 anammox 공정에서 Pseudomonadota의 높은 우점도는 여러 연구에서 보고된 바 있으며, 철은 Pseudomonas의 생물막 발달과 유지에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(^{Liu et al., 2017}; ^{Zhang, Chen et al., 2018}). 또한, Pseudomonadota는 anammox 미생물과 공생 관계에서 NO₂^-를 NO로 환원시키는 효소인 copper-containing nitrite reductase (nirK)와 cytochrome cd1-dependent nitrite reductase (nirS)를 발현하는 것으로 밝혀졌다(^{Lawson et al., 2017}).

Planctomycetota, Pseudomonadota, Chloroflexi, Bacteroidetes는 anammox 공정에서 높은 우점도를 가지는 대표적인 phylum으로 보고되었다(^{Chen et al., 2020}; ^{Zhang, Yang et al., 2018}). Actinobacteria는 AGs에서 IP-IAGs로 전환됨에 따라 우점도가 0.85%에서 4.02%로 증가하였다. Actinobacteria는 대표적인 사상성 미생물로 알려져 있으며(^{Nielsen et al., 2009}), 이 문에 속하는 미생물 중 일부는 iron reducing bacteria (FeRB)로 분류된다. 따라서, 철 입자 함입에 따라 FeRB의 증가로 Actinobacteria의 우점도가 상승한 것으로 추정된다(^{Hao et al., 2024}). Chloroflexi는 AGs에서 15.22%로 높은 우점도를 보였으나, IP-IAGs에서는 4.64%로 감소하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 Fe²⁺와 Fe³⁺를 투입한 다른 anammox 공정 연구에서도 유사한 경향이 관찰된 바 있다(^{Peng et al., 2022}; ^{Wang, Fan et al., 2022}). Chloroflexi는 사상성 형태를 통해 anammox 공정에서 생물막 및 그래뉼 형성에 기여하며(^{Kindaichi et al., 2012}; ^{Li et al., 2009}), 독립영양균에 의해 생성된 EPS와 soluble microbial products를 분해하여 그래뉼의 구조를 강화한다(^{Feng and Wu, 2021}; ^{Wang et al., 2020}; ^{Yang et al., 2018}). 또한, Chloroflexi는 질소 처리 공정에서 발생하는 단백질과 다당류(polysaccharide)와 같은 세포 잔해로부터 에너지를 공급받는다고 알려져 있다(^{Kindaichi et al., 2012}; ^{Xia et al., 2007}). 따라서, Chloroflexi의 우점도는 간접적으로 사멸 세포의 양을 나타낼 수 있다. 이를 기반으로 AGs에서 사멸 세포의 양이 IP-IAGs보다 많다는 것을 추론할 수 있다(^{Chen, Wu et al., 2021}).

Pseudomonadota는 하수처리장과 토양에서 가장 흔히 발견되는 phylum으로, 질산화 미생물(nitrite-oxidizing bacteria, NOB), 암모늄 산화 미생물(ammonia-oxidizing bacteria, AOB), 탈질 미생물 등을 포함하여 질소 제거 과정에 중요한 역할을 한다(^{Hao et al., 2022}). NO₃^-를 NO₂^-로 환원시키는 종속영양균에 의한 부분 탈질은 anammox 반응에 필요한 기질을 제공하여 공정에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, Pseudomonadota는 anammox 미생물의 중앙 탄소 대사에 중요한 엽산 및 molybdopterin 보조인자와 같은 필수 화합물을 합성하거나 제공할 수 있는 것으로 보고되었다(^{Zhao et al., 2018}). Chloroflexi와 Pseudomonadota 같은 종속영양 미생물은 Ca. Brocadia에 의해 합성된 비타민 B12를 활용하며, Pseudomonadota와 Bacteroidetes는 N₂O를 N₂로 환원시키는 nitrous oxide reductase (nosZ)의 유전자를 발현한다고 보고되었다(^{Lawson et al., 2017}). Bacteroidetes는 AGs에서 4.34%의 상대적 우점도를 보였으나, IP-IAGs에서 16.66%로 약 4배 증가한 것으로 확인되었다(Fig. 3). Bacteroidetes는 유기물질을 흡수하고 분해하는 데 효과적이며, 입자에 부착하여 생장하는 특성을 가진다(^{Fernández-Gómez et al., 2013}; ^{Suominen et al., 2021}). Bacteroidetes와 같은 종속영양 탈질균은 독립영양균에 의해 형성된 그래뉼 내부의 유기물질을 활용하여 생장한다(^{Matsumoto et al., 2010}). 이러한 anammox 미생물과의 공생은 자생 미생물들의 탈질 반응 활성을 증대시켜 반응기의 질소 제거 성능을 향상시키고, 궁극적으로 질소 순환에 기여할 것으로 판단된다.

탈질 미생물은 anammox 공정에서 기능적으로 필수적인 역할을 하며, anammox 미생물과 함께 질소 제거 공정에 큰 영향을 미친다(^{Wang et al., 2021}). 본 연구에서는 AGs에서 탈질 미생물인 Uncultured Denitratisoma sp.와 Denitratisoma oestradiolicum이 각각 9.52%와 6.10%의 우점도를 보였으나, IP-IAGs에서는 각각 우점도가 0.45%, 2.28%로 감소하였다. 이와 유사하게, ^{Mu et al. (2023)}의 연구에서도 anammox 공정의 활성 증가에 따라 탈질 미생물인 Denitratisoma와 Thiobacillus의 우점도 감소가 확인되었다. 이는 anammox 공정의 안정화 및 효율 증대와 함께 탈질 미생물의 우점도가 감소할 수 있음을 시사한다.

상대적 우점도가 0.1% 이상인 ASV 분석을 통해 식별된 phylum은 AGs에서 7가지였으나, IP-IAGs에서는 13가지로 증가하였다. Alpha 다양성 분석 결과, 값이 클수록 높은 다양성을 나타내는 Shannon index가 AGs에서 3.66, IP-IAGs에서 4.66으로 도출되어, 철 입자 함입 후 미생물 다양성이 증가했음을 확인할 수 있었다(Table 1). 하수 처리 공정에서의 높은 미생물 다양성은 처리 효율뿐만 아니라(^{Wang, Zheng et al., 2013}; ^{Wang, Guo et al., 2013}), 공정 안정성에도 긍정적인 영향을 끼친다(^{Mielczarek et al., 2013}). ^{Chen et al. (2020)}은 더 뚜렷한 그래뉼이 형성될수록 더 높은 종 풍부도를 가진다고 보고하였다. 따라서 철 함입에 따라 그래뉼 형성 미생물의 증가와 철 입자에 의한 그래뉼 형성으로 생물 다양성이 증가하고 종간의 풍부한 상호작용이 높은 질소 제거 성능을 보여준 것으로 판단된다.

3.3 실폐수 공정의 군집 변화

질소 제거 성능은 하수처리장의 실폐수인 혐기소화 반류수를 대상으로 평가되었다. 실폐수는 0.41 ± 0.02%의 염도, 7.8 ± 0.20의 pH, NH₄⁺와 CaCO₃의 몰분율은 1:0.5인 특성을 보였다. 이 폐수에 anammox 반응에 필요한 NO₂^-를 확보하기 위해 RW-PN 반응기를 anammox 반응기 전단에 설치하였다. RW-PN 반응기의 유입수 NH₄⁺농도는 815.14 ± 30 mg-N/L이었으며, nitrite nitrogen generation rate는 0.48 ± 4.42 kg-N/m³를 보였다. 후단의 RW-IAGs 반응기에는 최종적으로 NH₄⁺와 NO₂^-이 각각 421.63 ± 30 mg-N/L, 403.81 ± 34.16 mg-N/L가 유입되었다. 실폐수 반응기는 43 d 동안 12 h의 HRT로 운영되었으며, NRR은 1.41 ± 0.09 kg-N/m³⋅d, nitrogen removal efficiency (NRE)는 83.98%를 기록하였다.

담수나 토양에서 발견되는 대부분의 암모늄 산화 미생물은 Pseudomonadota에 속하며, RW-PN에서는 Pseudomonadota가 46.59%로 가장 높은 상대적 우점도를 보였다(^{Kong et al., 2017}; ^{Madigan and Martinko, 2005}; ^{Wang et al., 2017}). 그 뒤를 Bacteroidota, Uncultured bacterium, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Ignavibacteriae 등이 이었다(Fig. 5). 이전의 부분 질산화 공정 연구에서도 유사한 미생물 군집이 높은 우점도를 나타낸 바 있다(^{Li et al., 2018}; ^{Wei et al., 2018}; ^{Yuan et al., 2021}). Bacteroidota는 부패한 바이오매스에서 생성된 2차 대사산물과 질산화 미생물이 생산한 EPS를 대사하는 것으로 알려져 있다(^{Yang et al., 2017}). Actinobacteria는 다른 미생물보다 더 안정적인 세포 구조와 높은 적응성을 가지며, 이러한 특성은 미생물 생물막 유지에 기여한다(^{Zhu et al., 2015}).

Fig. 5. Representative phyla of RW-PN and RW-IAGs.

Fig. 6. Representative genera and species of RW-PN and RW-IAGs.

Fig. 7. PCoA analysis of the AGs, IP-IAGs, RW-PN, and RW-IAGs with 16s gene sequences.

상위 10개의 종 수준 분석 결과, Nitrosomonas가 가장 높은 우점도를 보였으며(Table 3), 이는 부분 아질산화를 수행하는 대표적인 미생물이다. 적정 CaCO₃ 농도와 적정 pH에 의해 NOB의 저해와 AOB의 활성이 효과적으로 이루어진 것으로 나타났다. pH 7.5–8.5의 조건은 NOB의 활성을 억제하고 NO₂^-의 축적에 기여하는 것으로 보고되었으며(^{Abeling and Seyfried, 1992}; ^{Villaverde et al., 1997}), 0.1–1.0 mg-N/L의 free ammonia 농도에서도 NOB의 저해 효과가 관찰되었다(^{Anthonisen et al., 1976}). NOB에는 대표적으로 Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina, Nitrospira의 종이 포함되는데, 반응조에서는 이러한 미생물의 우점도가 낮게 관찰되었다. 이는 성공적인 부분 아질산화가 발생했음을 시사한다.

RW-IAGs에서는 Pseudomonadota, Planctomycetota, Bacteroidota, Verrucomicrobia, Ignavibacteriae 등이 각각 35.47%, 19.78% 15.84%, 5.29%, 2.77%, 1.51%의 우점도를 나타냈다. 이 중 Planctomycetota는 RW-PN에서 0.87%의 우점도를 보였으나, RW-IAGs에서 19.78%로 높은 증가율을 확인하였다. 또한, 종 수준 분석 결과, Ca. Brocadia sinica, Ca. Jettenia, Uncultured anaerobic ammonium-oxidizing bacterium 등의 다양한 anammox 미생물의 높은 우점도가 관찰되었다. 이는 합성 폐수를 사용한 IP-IAGs에서와 마찬가지로 Ca. Brocadia와 Ca. Jettenia가 확인되었음을 보여준다. 이러한 결과는 RW-PN에서 RW-IAGs로 전환되면서 성공적인 anammox 공정이 구축되었음을 시사한다. 또한 AGs, IP-IAGs, RW-PN, RW-IAGs에 대한 beta diversity를 PCoA 분석을 통해 진행한 결과, 유입수의 성상이 다름에도 불구하고 IP-IAGs와 RW-IAGs의 유사도가 상당히 높게 나오는 것을 확인하였다. 이를 통해, 철 입자의 함입이 미생물 군집 변화에 큰 영향을 주었음을 확인할 수 있다.

3.4 철 함입 anammox 공정 사례에 관한 미생물 특성과 활용

Anammox 미생물은 1999년 처음 학계에 보고된 이후, 기존의 생물학적 질소 처리 공정을 대체하기 위해 활발한 연구가 진행되고 있다(^{Strous et al., 1999}). Anammox 공정은 폭기와 유기탄소 요구량이 현저히 낮아 기존 질산화-탈질 공정에 비해 경제적이고 환경친화적인 장점을 가진다(^{Hauck et al., 2016}). 이러한 공정의 성공적인 구현을 위해 미생물 군집구조를 이해하는 것은 필수적이며, 이에 대한 연구는 지속적으로 이루어지고 있다(^{Bhattacharjee et al., 2017}; ^{Pereira et al., 2017}). ^{Bhattacharjee et al. (2017)}은 suspended growth reactor (SGR)와 attached growth packed-bed reactor (AGR)에서 동일 조건으로 anammox 공정을 가동하여, 반응기 종류에 따른 anammox 군집구조의 변화를 연구하였다. 그 결과, Planctomycetota는 SGR보다 AGR에서 높은 우점도를 보였으며, AGR에서는 Chlorobi와 Proteobacteria가 SGR에 비하여 높은 우점도를 나타냈다. 또한, 우점하는 anammox 미생물은 SGR과 AGR에서 각각 Ca. Brocadia sp. 1, Ca. Brocadia sp. 2로 서로 다른 종이 관찰되었다. ^{Ni et al. (2019)}의 연구에서는 Conventional EGSB와 Granule circulating EGSB에서 서로 상이한 anammox 미생물 군집구조를 보였다. Conventional EGSB에서는 Ca. Brocadia의 우점도가 10.0%에서 17.1%로 증가한 반면, Ca. Kuenenia는 15.9%에서 12.6%로, Ca. Jettenia는 2.6%에서 관측 불가 수준으로 감소하였다. Granule circulating EGSB에서는 Ca. Kuenenia와 Ca. Brocadia는 각각 9.0%, 7.1%로 감소하였으며, Ca. Jettenia는 Conventional EGSB와 동일하게 관측되지 않았다. 이러한 차이는 반응기 형상, EGSB의 가동 조건, 또는 상이한 NRR과 같은 요인이 군집구조 변화에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다. Upflow anaerobic sludge blanket (UASB)를 통한 anammox 공정은 Table 4와 같이 다른 반응기 구조에 비해 높은 NLR, NRR, 총질소 제거 효율(total nitrogen removal efficiency, TNRE)이 확인되었다. 이러한 연구에서 Ca. Jettenia와 Ca. Kuenenia가 가장 우점하는 anammox 미생물로 확인되었다.

Anammox 미생물에서 질소 제거 효소의 주요 구성 요소인 Fe²⁺, Fe³⁺ 및 ZVI 등의 활용은 anammox 공정에서 NRE 증가에 큰 영향을 끼친다(^{Wang, Ren et al., 2023}). NRE를 증가시키기 위해 철을 활용한 anammox 미생물의 기능을 증진시키는 다양한 연구와 전략이 개발되었으며, 대표적으로 Fe²⁺, Fe₃O₄, ferrihydrite, maghemite nano particles (MHNPs), ZVI 등이 활용되었다(Table 5).

Heme C는 anammox 성능과 대사를 평가하는 데 적합한 지표로 보고되었다(^{Kartal et al., 2010}; ^{Tang et al., 2011}). ^{Xu et al (2020)}의 연구에서 Fe₃O₄의 투여량과 heme C간 유의미한 상관관계가 확인되었으며(p < 0.01), Fe₃O₄ 투여량이 200 mg/L로 최대일 때 specific anammox activity는 Fe₃O₄를 투여하지 않았을 때에 비해 1.6배 증가하였다. 이 연구에서는 Ca. Kuenenia가 우점종으로 확인되었으며, Fe₃O₄ 최대 투여 시, Ca. Kuenenia의 우점도가 25.1%에서 33.4%로 증가하여 Ca. Kuenenia의 상대적 우점도가 Fe₃O₄와 높은 상관관계(p < 0.05)를 가진다고 보고하였다. 또한, SBR에 Fe₃O₄를 투여해 anammox 공정을 가동한 연구에서도 Ca. Kuenenia가 우점종으로 관찰되었으며, 이는 Fe₃O₄ 투여가 Ca. Kuenenia와 높은 상관성을 가질 가능성을 시사한다(^{Zhang, Wei et al., 2022}). MHNPs를 anammox 공정에 투입했을 때 Ca. Kuenenia가 우점하였으며, MHNPs 투여로 인해 응집성이 향상된 것으로 보고되었다(^{Zhang, Cheng et al., 2018}). ^{Zhang, Xu et al. (2017)}의 연구에서는 nanoscale ZVI를 활용하여 높은 질소 농도의 유입수를 짧은 HRT 조건에서 처리했으며, 이때 우점 anammox 미생물 또한 Ca. Kuenenia로 확인되었다. 반면, ZVI를 활용한 다른 연구에서는 Ca. Brocadia가 가장 우점하는 종으로 관찰되기도 하였다(^{Zhang, Wang et al., 2022}).

Table 5에 제시된 바와 같이, 대부분의 철 입자가 함입된 anammox 공정에서 우점하는 anammox 미생물은 Ca. Kuenenia 또는 Ca. Brocadia로 관찰되었으며, 모든 공정에서 슬러지가 그래뉼 형태인 특징을 보였다. 본 연구에서도 IP-IAGs에서 anammox 미생물 중 Ca. Brocadia가 가장 높은 우점도를 보였으나, Ca. Jettenia의 우점도가 크게 증가했으며, 철 입자가 함입되지 않은 경우 Ca. Jettenia가 관측되지 않고 Ca. Brocadia가 가장 우점했다. 이러한 결과는 철 입자가 anammox 미생물 군집구조에 주요한 영향을 미쳤음을 시사한다. 또한, 철 입자가 함입된 후 anammox 미생물의 다양성이 증가하였으며, 이는 Ca. Jettenia뿐만 아니라 다른 anammox 미생물도 철 입자의 영향을 받은 것으로 추정된다. Anammox 미생물은 철 이온을 전자 수용체로 사용하는 특성을 가지며(^{Arumugham and Mohamad, 2022}; ^{Kartal et al., 2008}), Ca. Kuenenia stuttartiensis는 철을 함유한 단백질인 ferredoxin을 활용하여 N₂H₄의 고에너지 전자를 acetyl-CoA 합성효소로 전달한다고 밝혀졌다(^{Strous et al., 2006}). 이처럼 anammox 미생물은 철을 활용하는 생리적 특성을 가지고 있으며, 철 함입으로 anammox 미생물에 긍정적인 영향을 끼쳐 우점도가 증가하고 높은 활성을 보인 것으로 사료되며 추가적인 연구가 필요하다.

3.5 Anammox targeting primers

Anammox 미생물은 종에 따라 적응하는 환경이 달라 폐수 성상에 따라 군집 구조 변화가 관찰된다. Ca. Scalindua는 해수에서 관측되는 대표적인 anammox 종으로, 담수 환경에서 우점하는 다른 anammox 종들과 구별된다(^{Ali et al., 2020}; ^{Lin et al., 2021}; ^{Sonthiphand et al., 2014}). 각 종의 염분 내성 차이에 따라, 염분 농도에 따라 상이한 anammox 군집이 우점할 가능성을 유추할 수 있다(^{Okabe et al., 2024}). ^{Jeong et al. (2020)}의 연구에서는 반응기 내의 염도가 0 mg/L에서 20 mg/L로 증가했을 때, 낮게 관찰되던 Ca. Kuenenia의 우점도가 13.4%까지 증가한 반면, Ca. Brocadia는 크게 감소하였다. 이에 따라 Ca. Jettenia와 Ca. Kuenenia가 염분 환경에서 anammox 반응의 주요 구성 요소로 작용한 것으로 확인되었다. 또한, anammox 미생물은 종에 따라 성장에 적합한 pH가 다른 특성을 가진다. Ca. Brocadia sinica는 7.0–8.5, Ca. Brocadia anammoxidans는 6.7–8.3, Ca. Kuenenia stuttgartiensis는 6.5–9.0의 pH 범위에서 성장 가능한 것으로 보고되었다(^{Jetten et al., 2005}; ^{Oshiki et al., 2011}; ^{van Der Star, van de Graaf et al., 2008}). 이처럼 폐수 성상에 따라 anammox 미생물 활성이 달라지므로 정량적 분석을 시 특정 종으로 구체적으로 분석하는 것이 중요하다. 정량적 분석에서는 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)이 활용되며, primer와 probe를 설계하여 특정 종의 정량적 평가를 수행할 수 있다. 이를 위해, 기존 연구에서 anammox 미생물의 정량적 분석에 사용된 primer와 probe를 Table 6에 정리하였다.

Brod541F/Brod1260R와 An7F/An1388R은 Ca. Scalindua, Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia의 16S rRNA를 기반으로 설계되어 광범위한 anammox 미생물의 정량평가에 활용된다. 이 중 Brod541F/Brod1260R primer는 해수종인 Ca. Scalindua에 높은 특이성을 보이며, 특히 Brod541F는 Ca. Scalindua brodae와 100% 상응하는 것으로 밝혀졌다(^{Penton et al., 2006}). Amx694F/Amx960R은 UASB 반응기의 Ca. Kuenenia stuttgartiensis를 기반으로 설계되어, 이에 대해 높은 반응 효율을 나타내며, 전반적인 anammox 미생물의 정량을 목적으로 사용된다(^{Ni et al., 2010}; ^{Yang et al., 2020}). A438f/A684r primer 쌍은 습지 토양 샘플에서 anammox 미생물을 정량하기 위해 활용되었다(^{Humbert et al., 2012}). 특정 종을 목적으로 한 primer 설계도 이루어져 ^{Narita et al. (2017)}은 Ca. Brocadia sapporoensis를 대상으로 하는 primer 쌍인 BRSP454F/BRSP660R을 개발하였다. ^{Zhang, Narita et al. (2017)}은 qPCR로 각 anammox 미생물 종의 비성장속도 (μ)를 위한 최대비성장속도 (μ_max)를 결정하기 위해 설계된 primer BRS95F/BRS170R, JEC447F/JEC629R, SCJ447F/ SCJ629R을 계통발생학적으로 다른 Ca. Brocadia sinica, Ca. Jettenia caeni, Ca. Scalindua sp.에 적용하였다. 70 m³ 규모 반응기의 anammox 미생물을 정량하기 위해 Pla46F/AMX667R primer과 전반적인 anammox 미생물에 hybridization되는 AMX361, AMX381와 Ca. Kuenenia, Ca. Brocadia에 hybridization되는 AMX382 probe가 사용되었다(^{van der Star et al., 2007}). ^{Wang et al. (2015)}는 AMX368F/AMX820R이 Ca. Brocadia, Ca. Kuenenia에 높은 반응 효율을 보이며, Brod541F/AMX820R은 Ca. Scalindua wagneri에 대해 반응 효율을 가진다고 보고하였다.

Anammox 미생물의 유전체 분석 기술이 발전함에 따라 primer 제조를 위한 다양한 염기서열이 설계되었으며, 이는 functional gene 영역까지 확장되었다. 16S rRNA gene primer와 함께 functional gene primer는 생물 다양성, 풍부도, anammox 미생물 활성에 관한 중요한 정보를 제공한다(^{Yang et al., 2020}). 특히, functional gene의 증폭을 통해 적은 양의 anammox 미생물을 포함하는 샘플에서도 탐지 성능을 향상시킬 수 있다(^{Kartal, Geerts et al., 2011}). Hydrazine oxidoreductase (hzo)의 유전자는 N₂H₄를 N₂로 전환하는 역할의 효소를 생성하며, anammox 미생물의 생화학적 과정에서 핵심적인 역할을 한다(^{Schalk et al., 2000}). Ca. Jettenia를 포함한 다양한 anammox 미생물 군집에서 hzo 유전자가 관찰되었으며(^{Quan et al., 2008}; ^{Shimamura et al., 2007}), ^{Schmid et al. (2008)}은 hzo 유전자를 감지하기 위한 여러 가지 primer 쌍을 제안하였다. 이중 hzocl1F1/hzocl1R2 primer가 높은 반응 효율을 보였으며, hzoF1/hzoR1 primer는 인간 활동으로 인해 영향을 받은 해양 생태계에서 anammox 미생물 탐지에 효과적으로 사용되었다(^{Li et al., 2010}). nirK는 NO₂^-를 NO로 환원하는 효소로 Ca. Jettenia에서 발견된 반면, Ca. Brocadia에서는 발견되지 않는 특징을 지닌다. 이를 기반으로 Ca. Jettenia의 nirK 유전자를 정량을 위해 nirKf/nirKr가 설계되었다(^{Hira et al., 2012}). 또한, hzs 유전자는 다른 genome에서는 발견되지 않는 anammox 미생물의 특이적 유전자로 평가되며, 이를 위한 primer hzsA_ 526F/hzsA_1857R이 설계되었다(^{Harhangi et al., 2012}). hzs는 anammox 미생물에 필수적인 기능성 효소이며, hzsA, hzsB, hzsC 세 가지 구조로 이루어져 있다. ^{Wang et al (2021)}은 hzsB 유전자가 anammox 활성 평가를 위한 유용한 지표로 활용 가능성을 보고하였다. ^{Wang, Ni et al (2016)}의 연구에서는 hzo와 hzs를 qPCR을 통해 정량화한 결과, 질소 제거 성능과의 상관관계에서 R² > 0.96으로 높은 연관성이 관측되었다. 이러한 결과는 특정 anammox 종이나 functional gene에 대한 정량적 분석이 anammox 공정의 이해와 제어에 있어 중요한 도구가 될 수 있음을 시사한다.