2.1 이론적 배경

저출력 광선 요법인 LLLT(Low Level Light Therapy)를 적용한 기기들의 경우, 낮은 출력을 갖는 광원의 안전성과 빛의 조사만으로 피부에 케어 효과를 줄 수 있어 활발한 연구 및 개발이 이루어지고 있다^[3-5]. 특히 LED 광원은 일반적으로 파장이 길수록 조직 내 깊이 침투가 가능하다. 조직 유형에 따른 파장별 침투 깊이는 400nm는 1mm 미만, 514nm는 0.5~2mm, 630nm는 1~6mm, 700~900nm는 하피 부위까지 침투가 가능하다. 따라서 피부 조사용 LED 광원은 피부 조사 부위나 용도(항진균 또는 세포 활성)에 따라 파장을 선정하는 것이 치료 효과를 향상시키는데 중요하다^[6-10].

말라쎄지아는 피지 분비가 많은 정상 피부에 존재하며 건강한 성인의 75~98%에서 발견되는 상재진균이지만 말라쎄지아 모낭염, 어루러기, 지루성 피부염, 아토피 피부염, 건선과 같은 질환을 유발시키거나 악화시키는 등 병인에 관여하는 것으로 알려져 있다^[2]. 말라쎄지아가 피부 질환에 관여하는 정확한 기전은 아직까지 알려져 있지 않지만 최근의 연구들에서는 이 들의 개체수 감소가 질환의 호전을 보이는 것으로 보고되고 있다^[2,7].

두피 세포 활성화에 관한 광 조사 세포시험에서는 인간 모낭 진피 모유두 세포(Human Follicle Dermal Papilla Cells, HFDPC), 모발 성장 촉진 인자(IGF-1, VEGF, TGF-β)의 변화를 관찰하여 LED를 이용한 광 치료 효과 및 인체 안정성을 확인하였다. 두피 정상세포의 활성 시험에 사용된 모유두 세포는 모낭 끝에 있는 작은 말발굽 모양의 돌기 조직으로서 모발을 형성시켜주는 특수하고 작은 세포층이며, IGF-1(Insulin-like growth factor-1)은 세포증식을 유발하는 성장인자로서 모낭의 면역 활동을 회복시키고 성장촉진효과를 나타낸다. 혈관 내피 성장 인자인 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 또는 VEGF-A)는 모낭의 혈관신생을 통해 모발 성장을 촉진시키는 인자이고, TGF-β는 퇴화기(Catagen) 유도제이지만 모발 성장기 재진입(Anagen re-entry)에 기여하는 것으로 알려져 있다^[2-5].

2.2 광원 시료

시료는 두피 조사용 LED 광원이며, 광 의료기기 개발업체인 티아이피인터내셔날(주)에서 제공하였다(Fig. 2). A~E 시료는 M.sympodialis 항진균 시험에 이용되었으며, C~G 시료는 정상세포에 대한 독성 및 활성 시험에 사용된 시료이다. A와 B 시료의 첨두파장은 393 ± 3nm이며, C~G 시료는 동작 모드별로 첨두파장이 393 ± 3nm, 630 ± 1nm, 850 ± 1nm로 각각 구동이 가능하도록 다파장 LED가 적용되었다.

2.3 광학 특성 시험

광학 특성 측정에 사용된 장비는 C type 배광기이다(Table 2). 세포 시험에서 사용되는 세포 배양 플레이트의 지름은 약 5.28cm 이며(Fig. 3), LED 광원은 두피에 근접하여 조사하는 광원이므로 광 조사거리는 1.4cm로 자체 설정하였다.

광학 특성 시험에서 LED 광원의 회전 조건은 γ plane은 0°~90° 범위 내에서 2° 간격이고 C plane은 0°~360° 범위 내에서 90° 간격으로 이동하며, 배광기 내 고정된 디텍터로 복사선속(W_θ)을 측정하였다.

광학 시험 후 그림. 4와 같은 광 조사 세포 시험 조건에서 세포에 광이 조사될 때, 사용된 세포 배양 플레이트의 반지름(X)와 광 조사거리(Y)를 이용한 광 지향각(θ) 산출식은 다음과 같다.

상기 식 (1)의 광 지향각은 광 조사 세포시험에서 세포 배양 플레이트 내로 광이 조사되는 각도이며, 본 연구에서 광 지향각은 약 62°로 최종 산출되었다. 광 지향각 범위 내의 복사선속 총량이 W_θ이며, 세포 배양 플레이트의 바닥면적이 S_plate일 때, 세포 배양 플레이트 내 세포에 직접 조사된 수평면 복사조도(E_θ)는 식 (2)와 같다.

최종적으로 에너지 밀도[J/cm²]는 복사조도(E_θ)와 세포에 광을 조사한 시간[s]을 곱하여 산출하였다.

2.4 광 조사 조건

세포 배양 플레이트 내 배양된 세포로부터 1.4cm의 거리(Y)에서 광을 조사한 후 세포의 생존력을 평가하였다(Fig. 4). 광 조사 세포 시험은 총 2종으로 진행하였으며, M.sympodialis의 항진균 시험과 두피 정상세포의 활성 시험으로 구분하여 시험하였다. 세포시험에서 광 조사는 각각 표 3과 표 4의 조건으로 연속파 광을 조사하였다.

2.5 M. sympodialis의 항진균 시험

비듬을 일으키는 균주 중 말라쎄지아 진균에 대한 LED의 항진균 효과는 MIC 농도(최소 억제 농도, Minimum Inhibitory Concentration) 측정법을 통한 진균 개체수를 파악하여 진균 증식이 억제된 광 특성을 확인하였다. 진균 배양은 공시균주인 Malassezia sympodialis (M. sympo, KCTC No. 7985)를 Modified Leeming & Notman 배지(glucose 20g, malt extrat 50g, polypeptone 1g, bile salts (oxid) 20g, tween40 0.1g, glycerol 0.02g, agar 15-20g, D.W 1000ml)에 접종하여 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 균주는 해동 후 두 번 계대한 것을 사용하였으며, 표 3의 시험조건에 따라 광을 조사한 후 세포 생존율을 계산하였다. 세포 생존율[%]은 실험군의 진균 개체수를 광이 조사되지 않은 대조군의 진균 개체수로 나누어 백분율로 표시하였다.

2.6 두피 세포의 활성 시험

두피 세포는 인간 모낭 진피 모유두 세포(Human Follicle Dermal Papilla Cells, HFDPC, PromoCell사, Cat.No.C-12072)를 이용하였으며, 모발 성장 촉진인자인 IGF-1과 VEGF의 발현 증가량을 확인하였다. 평가 방법은 LED 광 조사 후 세포 내 RNA 발현 관련하여 IGF-1을 분석하는 RT-PCR법과 분비된 단백질(VEGF) 발현을 평가하는 ELISA법을 이용하였다. 세포 배양은 액체 질소통에서 HFDPC를 꺼내어 재빨리 37℃ water bath에 넣고 해동시킨 후, 해동된 세포(1ml)를 세포배양액(9ml)이 들어있는 15ml cornical tube 안에 넣고 800RPM 5min, 실온 조건 하에서 원심 분리하였다. 침전된 세포 pellet만 남기고 배양액은 버렸으며, 세포에 새 배양액을 5ml 넣어준 후 pellet을 잘 풀어주고 T150 Flask로 세포를 전부 옯겨주었다. 새 배양액 15ml을 추가로 넣어준 후 세포를 고르게 도포한 후 현미경으로 세포상태를 관찰하고 세포를 5% CO₂ incubator 안에 넣고 시험기간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 표 4의 시험조건에 따라 광 조사 세포시험에 사용되었다. 사용된 LED 광원의 시료수는 총 5개이며, 광 조사모드는 각각 630 ± 1nm, 850 ± 1nm로 구분하여 시험하였다(Table 3). LED를 이용한 두피 정상세포(HFDPC)에 대한 활성 효과는 HFDPC에 LED 광을 조사하고 24시간이 지난 후 모발 성장 관련 인자들의 발현율을 확인하였다.

3.1 M. sympodialis에 대한 항진균 시험결과 및 고찰

표 5는 첨두파장 393 ± 3nm LED 광원에 대한 광학 특성 시험 결과이며, 표 6은 M. sympodialis을 배양액에서 키운 다음 10-4으로 희석하여 세포 배양 플레이트에 넣고, 배양된 세포로부터 1.4cm의 거리에서 LED 광을 조사한 후 진균 생존력을 시험한 결과이다. 사용된 LED 광모듈은 A~E까지 총 5개이다. Mean 값은 M. sympodialis의 개체수이며, 시료당 1회씩 측정된 결과이다. 시험결과에 사용된 용어 정의는 다음과 같다. 복사선속(Radiant flux)은 광원에서 전방향으로 방출된 에너지양이며, 62° 이내의 복사선속은 플레이트 내 진균에 직접 조사된 에너지 양이다. 복사강도(Radiant intensity)는 LED 광원의 정중앙부(c-plane 0°, γ-plane 0° 지점)에서 검출된 복사강도이다. 복사조도(Irradiance)는 세포시험에서 진균에 조사된 수평면 복사조도이다. 대조군은 광 조사 시간이 0초이며, 비교 분석을 위하여 각각의 시료마다 대조군을 측정하였다. 억제율(Inhibition rate)은 광이 조사되지 않은 대조군과 광이 조사된 시험군 간 진균 개체수의 비율이며, 항진균 효율(Antifungal efficiency)은 에너지 밀도(Energy density)와 M. sympodialis 억제율(Inhibition rate) 간의 비율이다.

시험결과에서 393 ± 3nm LED 광원을 이용하여 광 조사한 모든 시험군에서 항진균 효과가 관찰되었다(Table 6). 에너지 밀도에 비례하여 증가한 항진균 효과는 증가하였으며, 에너지 밀도를 변수로 각각 광이 조사된 시험군의 M. sympodialis을 세포 배양 플레이트 내 도말하여 항진균 효과를 육안으로도 확인할 수 있었다(Fig. 5). 또한 시료 A와 B는 나머지 시료들과 비교해 볼 때 에너지 밀도 당 항진균 효율이 각각 2.9배, 3.8배로 더 높았다(Fig. 6). 특히 시료 B는 진균 억제율이 96.9%로 가장 높은 항진균 효과를 보였으며, 90% 이상의 항진균 효과를 보인 모든 시험군들 중에서 광 조사시간이 가장 짧은 960초로 확인되었다.

세포마다 특정 시간 내 광 흡수량이 다르며, 인체의 다양한 세포 조직은 고유한 광 흡수 특성을 가지고 있다^[1,3]. 따라서 M. sympodialis 진균도 마찬가지로 흡수할 수 있는 유효한 에너지 밀도 범위를 갖고 있는 것으로 판단된다. 시험결과에서 M. sympodialis 진균이 시간당 흡수할 수 있는 에너지 밀도의 임계점에 근접하여 광이 조사되며, 복사에너지 밀도 당 항진균 효율이 가장 높은 광원은 시료 A 임을 알 수 있었다(Fig. 6).

시료 C, D, E를 이용한 시험군들은 0~10,000초까지 광 조사시간을 다양화하여 시험하였으나 항진균 복사에너지 효율은 최대 1.3%로 관찰되었다. 또한 90% 이상의 진균 억제율이 발생하는 광 조사시간은 시료 A와 B를 이용한 시험군에서 960~1,200초로 확인되었으나, 시료 C, D, E는 8,700~10,000초로 상대적으로 긴 시간동안 광 조사가 필요한 것으로 확인되었다. 따라서 M. sympodialis 항진균에 효과적인 393 ± 3nm 광원은 시료 A와 B 광원으로 판단된다. 특히 시료 A는 광 조사시간이 150초, 600초 일 때 M. sympodialis 억제율은 각각 23.7%, 73.4% 였으며, 에너지 밀도 당 항진균 효율이 각각 4.6%, 3.5%로 모든 시험군 중에서 가장 높았다. 기존의 선행연구 결과에 따르면 380 ± 2와 392.5 ± 1 nm LED에서 각각 5 J/cm² 이하에서는 세포에 영향을 주지 않았으나, 10 J/cm² 이상으로 LED 조사시 각질형성세포의 생존율이 감소하는 것으로 확인된다^[2]. 이와 같이 조사된 에너지 밀도가 높아질수록 정상세포의 생존율도 낮아질 수 있는 점을 고려해볼 때, 높은 에너지 밀도로 진균 개체수를 최저로 유지하는 것 보다 에너지 밀도를 낮추면서 항진균 효율이 높은 것이 인체 안전성 측면에서 두피 케어용 광원에 적합할 것으로 판단된다. 시료 A를 이용한 M. sympodialis의 항진균 시험 결과를 통한 에너지 밀도의 유효 에너지 구간은 5.2J/cm²(150초) $\leqq$ [유효 에너지] $\leqq$ 41.4J/cm²(1,200초) 이며(Table 6), 시료 A와 B의 광학 시험 결과를 통한 복사조도의 유효 에너지 구간은 0.035W/cm² $\leqq$ [유효 에너지] < 0.067W/cm² 임을 확인하였다(Table 5). 이를 통해, 에너지 밀도가 낮더라도 복사조도를 최적화하여 광을 조사하는 경우에 M. sympodialis 항진균 효과를 증가시키는데 유리함을 알 수 있었다. 또한 진균 억제율은 복사에너지 밀도와 비례하여 증가하였으나, 광원을 임상 적용할 경우에 에너지 밀도를 낮추면서 진균에 조사되는 복사조도를 최적화하는 것이 두피 조사용 LED 광원의 인체 안정성 및 항진균 효과를 향상시키데 효과적일 것으로 판단된다.

3.2 두피 세포의 활성 시험결과 및 고찰

표 7은 첨두파장 630 ± 1nm, 850 ± 1nm LED 광원에 대한 광학 특성 시험 결과이며, 표 8~표 9는 인간 모낭 진피 모유두 세포(HFDPC)에 LED 광을 조사하고 24시간이 지난 후 모발 성장 관련 인자(IGF-1, VEGF)의 발현을 시험한 결과이다. 시험 결과, HFDPC 세포 활성에 유리한 파장별 광원의 유효한 에너지 구간은 630 ± 1nm 광원의 경우에 [유효 에너지] < 5 ± 0.17J/cm²(3,534∼3,771초)이며, 850 ± 1nm 광원은 20 ± 0.22J/cm²(4,348∼4,762초) $\leqq$ [유효 에너지] 임을 확인하였다(p < 0.05).

630 ± 1nm와 850 ± 1nm 광을 조사한 모든 시험군에서 모발 성장 인자인 IGF-1과 VEGF가 증가하였다(Table 8,Table 9). 또한 630 ± 1nm의 5 ± 0.17J/cm²과 850 ± 1nm의 20 ± 1.22J/cm² 광을 조사한 경우에 광을 조사하지 않은 정상군에 비해 VEGF의 분비양이 가장 높았으며, 각각 37.9%, 44.0%까지 증가함을 확인하였다(p < 0.05). IGF-1 발현율은 630 ± 1nm의 5 ±0 .17J/cm²과 850 ± 1nm의 20 ± 1.22J/cm² 광을 조사한 경우에 가장 높았으나, 630 ± 1nm 광은 에너지 밀도가 높아질수록 IGF-1 발현율이 감소하였다. 특히 630 ± 1nm의 5 ± 0.17/cm²에서는 IGF-1 발현율이 0.6%로 감소함에 따라 인체 안전성 확보를 위한 광 조사 임계점이 5 ± 0.17/cm²에 근접하는 것으로 판단된다. 반면에 850 ± 1nm 광은 IGF-1와 VEGF 발현율이 에너지 밀도와 비례하여 모든 시험군에서 증가하였다. 특히 850 ± 1nm 광은 복사에너지 밀도가 4 ± 0.25J/cm²와 10 ± 0.61J/cm² 일 때 IGF-1 발현률이 각각 20.5%, 21.4% 였으나, 20 ± 1.22J/cm²에서는 발현률이 40.1%로 급격히 증가함을 확인하였다. 따라서 850 ± 1nm 광은 10 ± 0.61J/cm²와 20 ± 1.22J/cm² 구간 사이에 광 조사량 대비 IGF-1 발현 효율이 높은 유효에너지 구간이 존재함을 알 수 있었으며, 20 ± 1.22J/cm² 이상의 에너지 밀도에서는 모발 성장 인자의 발현이 더욱 증가할 것으로 판단된다(Fig. 8,Fig. 9).

LED 조사 후 HFDPC에 염증이 유발되는지 알아보기 위한 대표적인 염증 바이오 마커를 이용한 시험 결과에서는 630 ± 1nm의 5 ± 0.17J/cm² 광을 조사한 경우에 염증인자인 COX-2의 발현이 정상군에 비해 증가하였으나, 850 ± 1nm를 조사한 시험군에서는 염증 인자(COX-2, MMP-2)의 발현이 정상군(Control)과 비교해 변화가 없는 것으로 관찰되었다(Fig. 7). 따라서 630 ± 1nm 광은 850 ± 1nm와 달리 에너지 밀도가 높아질수록 IGF-1 발현율이 감소됨에 따라 복사에너지 밀도를 최소화하여 두피 케어용 광원으로 이용하는 것이 인체 안정성 확보에 유리할 것으로 판단된다. 이를 통해, 모발 성장 인자 촉진을 유도한다고 알려진 630 ± 1nm와 비교하여 850 ± 1nm 광 조사에 의해서도 모발성장인자들의 발현이 증가함을 확인하였으며, 두피 건강에 630 ± 1nm와 함께 이용될 수 있을 것으로 판단된다.