(1) 박테리아 군집 시료

측정 시료인 세 박테리아 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes는 BHI broth 배지에 37°C에서 24시간 동안 배양되었다. 상기 박테리아 배양 과정 이후, 1µl를 취하여 BHI agar 배지에 스프레딩(spreading) 방법으로 37°C에서 E. coli와 S. typhimurium는 12시간, L. monocytogenes는 24시간 동안 배양되었다. 세 균은 각각 다른 플레이트(plate)에 배양되었으며, 플레이트 당 10-100개의 박테리아 군집을 얻을 수 있었다. 배양된 박테리아 군집들의 크기는 세 종류의 균 모두 약 0.8-2.2mm 범위에 존재하였다.

(2) 발산 각도 측정을 위한 장치 구성

그림 1은 박테리아 군집의 광 산란 패턴 이미지를 얻기 위한 실험 모식도를 보여주고 있다. 박테리아 군집에 조사(illumination)하기 위한 532nm 레이저(CNI, MGL-III) 출력은 단일 모드 광섬유(single-mode fiber)를 통해 도파되고, 도파된 빛은 단일 모드 광섬유 출력단에 설치된 초점 거리가 150mm인 이중볼록 렌즈(biconvex lens)(Thorlabs, LB14367)를 거쳐 박테리아 군집에 입사된다. 박테리아 군집에 입사되는 레이저 빔(beam)은 군집의 크기에 비해 클 경우 회절(diffraction) 현상이 발생하여 산란 패턴에 혼선(crosstalk)을 발생시키게 된다. 따라서 이를 최소화하기 위해 이중볼록 렌즈의 높이를 조절하여 입사 빔의 크기가 박테리아 군집의 크기와 거의 일치하도록 조절하였다. 박테리아 군집에서 생성되는 광 산란 패턴은 CMOS 카메라(Edmund, 46-144)를 이용하여 획득하였으며, 카메라에서 획득한 이미지 정보는 모니터와 PC로 전달하여 육안 관측 및 이미지 정보 저장이 가능하도록 하였다. 모니터를 통한 육안 관측 시 박테리아 광 산란 패턴을 선명하게 얻기 위해서는 산란 패턴의 초점에 맞춰 카메라의 위치를 적절히 조절하는 것이 중요하다. 이를 위해 카메라를 2축(xz) 스테이지에 부착하고, 이 스테이지를 통해 카메라의 위치를 정밀 조절하여 선명한 박테리아 광 산란 패턴을 획득하였다. 상기 2축 스테이지는 μm 단위로 위치 조정이 가능하고, z축 조절을 통해 산란 광의 초점에 맞춰 산란 패턴의 선택적 촬영이 가능하도록 만들어준다.

(1) 산란 패턴 측정 결과

그림 2(a), 2(b), 2(c)는 그림 1의 셋업을 이용하여 획득한 세 박테리아 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes의 광 산란 패턴들을 각각 보여주고 있으며, 군집 직경이 약 1mm로 비슷한 세 균을 선별하여 촬영한 결과를 보여주고 있다. 서론에서 언급하였듯이 박테리아의 광 산란 패턴에 관해서 균의 하위 분류에 속하는 종속 균들 간 비교, 군집 직경의 크기 및 배양 시간에 따른 비교, 카메라 위치 변경 또는 패턴 내 고리 수 비교 등 여러 방법을 이용하여 광 산란 패턴의 분석에 관한 연구가 다수 이루어져 왔다. 하지만 그림 2에서 나타낸 것처럼, BHI 배지에 세 균을 각각 배양했을 경우, 광 산란 패턴이 유사하여 패턴의 특징에 따라 박테리아 종류를 식별하는 것이 쉽지 않은 것을 알 수 있다. 광 산란 패턴의 크기는 레이저 빔이 조사되는 박테리아 군집의 크기에 따라 변하며, 비슷한 크기의 군집에서도 박테리아의 종류에 따라 산란 패턴의 크기가 조금씩 다른 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 광 산란 패턴의 크기는 주로 박테리아 군집의 크기 및 광 발산 각도에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 박테리아 군집별로 광 발산 각도를 측정하고, 그 차이를 분석하여 세 균을 구별해보고자 하였다.

(2) 발산 각도 측정 원리

그림 3은 박테리아 광 산란 패턴의 발산 각도를 계산하기 위한 모식도로 박테리아 군집 크기, 광 산란 패턴 크기, 광 발산 각도 간의 관계를 보여주고 있다. 박테리아 광 산란 패턴이 얻어질 때 빛의 진행 경로는 마치 빛이 렌즈를 통과한 후 진행하는 모습과 유사하다. 즉, 박테리아 군집에 입사된 빛은 마치 빛이 렌즈를 통과하듯이 군집을 통과하고 초점을 향해 집중된 후 다시 넓게 퍼지며 진행한다. 그림 3에서 점선은 빛의 진행 경로를 나타내며, a는 군집의 직경, b는 광 산란 패턴의 크기, c는 군집과 초점까지의 거리, f는 초점에서 산란 패턴 경계까지의 거리, 그리고 θ는 발산 각도이다. 여기서 a와 b는 측정을 통해 얻어질 수 있고, 군집(플레이트)에서 산란 패턴까지의 거리는 27cm로 고정되어 있다.

따라서, 상기 식 (1)-(3)을 통해 발산 각도를 계산할 수 있으며, 식 (3)에서 계산되는 발산 각도는 θ/2로 실제 발산 각도의 절반 값이지만, 본 논문에서는 편의상 이 값을 발산 각도라고 표현하고 사용하였다.

(3) 발산 각도 측정 결과

그림 4, 5, 6은 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes에 대한 발산 각도 획득 빈도수를 각각 보여주고 있으며, 박테리아 별로 발산각 획득 빈도수가 각기 다르게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 또한 상기 세 균의 발산각 획득 빈도수에 대한 가우시안(Gaussian) 분포 기반 비선형 회귀 분석 결과를 함께 나타내었다. 가우시안 분포는 확률 밀도 함수(probability density function)로 치환하여 해석이 가능하며, E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes의 발산각 획득 빈도수를 확률적으로 분석할 수 있었다. 본 연구에서는 상기 가우시안 분포의 최댓값을 기준으로 하는 일정한 면적의 전체 넓이에 대한 비율, 즉 발산각 획득 확률에 따라 세 박테리아 군집의 발산 각도 분포 범위를 산출하였다. 그리고 면적을 산정할 때에는, 최댓값을 중심으로 왼쪽과 오른쪽의 면적이 같아지도록 하였다. 예를 들어, 75%의 발산각 획득 확률을 가정할 경우, 세 박테리아 군집들의 가우시안 분포에서 최댓값을 기준으로 하는 면적(회색 표시)이 전체 넓이의 75%가 되도록 조정하여 발산각 분포 범위를 산출하였다. 이때, 세 박테리아 군집의 발산각 분포 범위는 E. coli의 경우 4.08°∼8.54°, S. typhimurium의 경우 6.81°∼11.96°, L. monocytogenes의 경우 9.88°∼16.68°로 도출되었다. 동일한 방식으로 65%의 발산각 획득 확률을 가정할 경우, 세 박테리아 군집의 발산각 분포 범위는 E. coli에 대해 4.37°∼7.92°, S. typhimurium에 대해 7.60°∼11.39°, L. monocytogenes에 대해 10.79°∼15.89°로 산출되었다.

이를 통해 발산각 획득 확률에 따라 산출된 발산각 분포 범위로부터, 획득 확률이 높아질수록 박테리아 별 발산각 분포 범위 또한 넓어져 박테리아 군집 간 중복되는 분포 영역이 증가하는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서는 E. coli와 S. typhimurium 그리고 S. typhimurium과 L. monocytogenes 간 발산각 중복 분포 영역을 1.3° 미만으로 유지시킬 수 있는 발산각 획득 확률 중 최댓값인 70%를 기준 획득 확률로 선정하고, 선정된 획득 확률에서 얻어지는 발산각 분포 범위를 박테리아 군집 별 최적 발산각 분포 범위로 지정하였다. 이 때, 발산각 중복 분포 범위를 1.3° 미만으로 산정한 이유는 세 박테리아의 발산각 분포 경계 영역에서 발생할 수 있는 측정 오차를 일부 고려하면서도 발산각 획득 확률을 높게 유지함으로써 박테리아 분별을 위한 효율적인 발산각 분포 범위를 선별하기 위한 것이다. 상기 선정된 발산각 획득 확률 70%로 도출되는 최적 발산각 분포 범위는 E. coli의 경우 4.23°∼8.12°, S. typhimurium의 경우 7.32°∼11.63°, L. monocytogenes의 경우 10.36°∼16.37°이었다. 상기 최적 발산각 분포 범위에서 E. coli와 S. typhimurium의 발산각 중복 분포 범위는 ∼0.8°, S. typhimurium과 L. monocytogenes의 발산각 중복 분포 범위는 ∼1.27°이었다. 상기 도출된 최적 발산각 분포 범위에서 실제로 측정된 발산각 획득 빈도수를 기반으로 발산각 획득 확률을 구해보면 E. coli는 ∼71.5%, S. typhimurium은 ∼70.9%, L. monocytogenes는 ∼70.4%로 계산되었다. 그리고, 실제 측정된 발산각 획득 빈도수와 가우시안 분포의 편차는 평균적으로 E. coli는 ∼0.55, S. typhimurium은 ∼0.53, L. monocytogenes는 ∼0.55로 계산되었다. 이처럼 가우시안 분포를 통해 선정한 획득 확률과 실험적으로 구한 획득 확률에 차이가 발생하는 이유는 상기 언급된 실제 획득 빈도수와 회귀 분석된 빈도수 간 편차 때문이며, 이러한 편차의 발생 원인은 박테리아 배양 환경에 따라 배양 과정에서 발생하는 군집 높이 및 형상의 변화에 의한 발산각 변화 때문으로 사료된다. 더불어, 박테리아들의 최대 획득 빈도수는 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes가 모두 8회로 최대 획득 빈도수를 갖는 특정 발산 각도는 해당 균의 최적 발산각 분포 범위 내에 속하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같이 확률 밀도 함수로 접근하여 발산각 분포 범위를 추정하였을 경우에 보다 쉽게 박테리아 간 구별이 가능하며, 획득 빈도수의 분석 과정에 있어 편차를 적정히 보정함으로써 유사하거나 더 높은 확률로 박테리아 군집들을 구별하는 것이 가능함을 확인하였다. 그림 7은 상기 세 박테리아 군집들의 발산 각도를 박테리아 군집 직경(0.8-2.2mm)에 따라 도시한 결과를 보여주고 있다. 연한 분홍색(■), 녹색(●), 청색(◆)으로 표시된 영역 E, S, L은 각각 이전 과정에서 도출했던 세 박테리아 군집의 최적 발산각 분포 범위를 나타내고 있다. 그림 7에서 알 수 있듯이 상기 영역 E, S, L에 실제 측정된 세 박테리아 군집들의 발산 각도가 집중적으로 분포하는 것을 확인할 수 있다. 영역 L에서는 E와 서로 중복되는 발산 각도 범위가 존재하지 않으며, 실제 측정에서도 E. coli의 발산 각도는 L 영역의 범위에서 거의 나타나지 않았기 때문에 L. monocytogenes와의 구별이 수월하다. 그러나, 영역 S는 영역 E 및 L과 중복되는 발산 각도 범위가 존재하기 때문에 S. typhimurium은 7.32°∼8.12° 및 10.36°∼11.63°의 발산 각도 범위에서 각각 E. coli 및 L. monocytogenes와 구별이 어려울 수 있다. 따라서 박테리아 분별 신뢰도를 높이기 위해서는 다량의 박테리아 군집에 대한 광 산란 패턴의 발산 각도 측정을 통해 조사된 발산 각도의 분포 범위를 산출하여 이를 기반으로 박테리아 종류에 대한 판정을 내려야 한다. 이와 같이 E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes는 서로 구분이 가능한 고유의 발산각 분포 범위를 가지므로 세 균의 식별 뿐만 아니라 두 균 간의 분별 즉, ‘E. coli 및 S. typhimurium’, ‘S. typhimurium 및 L. monocytogenes’, ‘E. coli 및 L. monocytogenes’ 에도 선택적 적용이 가능할 것으로 판단된다. 결과적으로 세 박테리아 군집들에 대해 광 산란 패턴의 발산각 획득 빈도수를 분석함으로써, 박테리아 군집별로 고유의 최적 발산각 분포 범위가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 박테리아 군집별 최적 발산각 분포 범위의 차이는 박테리아의 증식 및 성장 특성과 관련된 고유 특성에 기인한 것으로 추정된다.