1. 서 론

2019년 11월, 중국 후베이성 우한시에 처음으로 코로나바이러스(coronavirus)의 새로운 형태인 SARS-CoV-2가 발견되었다^{[1, 2]}. 최초 보고 이후, 새로운 변종인 SARS-CoV-2는 중국을 넘어 전세계적으로 확산 및 유행되었으며 사태의 심각성이 확인된 2020년 1월 31일, 세계보건기구(WHO)에서 SARS-CoV-2로 인한 감염증을 COVID-19이라 명명하고 범유행전염병(pandemic)으로 선포하였다. 지금까지 수많은 연구자들이 바이러스 혹은 항원(antigen) 및 항체(antibody)를 검출하기 위한 다양한 연구를 수행하였다^[3-7]. 이러한 연구 중 광섬유를 이용한 검출 방법은 검출 센서 구조의 소형화 및 경량화, 전자파 간섭에 무관한 특성들로 인해 많은 주목을 받아 이전부터 온도, 습도, 비틀림 등 다양한 물리적 변화 측정에 사용되었다^[8-12]. 대표적인 예로서 Zheng 연구진들은 다중 모드 광섬유(multi-mode fiber: 이하 MMF)와 코어가 없는 광섬유(no-core fiber: 이하 NCF)로 구성된 MMF-NCF-MMF 구조를 구현하고, 구조 표면에 발생하는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용하여 인간 면역 글로블린 G(human immunoglobulin G)를 검출하였다^[13]. 또한, Esposito 연구진들은 이중 피복 광섬유(double cladding fiber : 이하 DCF)에 장주기 광섬유 격자(long - period fiber grating: 이하 LPFG)를 새겨 C-반응성 단백질 검출에 활용하였다^[14]. 최근에는 위상 천이(phase shift)된 LPFG 및 표면 처리를 통한 항체 고정 기법을 이용하여 비표지 방식(label-free)의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출방안에 대한 연구가 보고되기도 하였다^[15]. 그러나 제안된 광섬유 기반 바이오센서들은 센서의 민감도를 높이기 위해 부가적인 기법(SPR 생성을 위한 구조 및 광섬유 격자 제작 등)들이 요구되고, 이에 따라 상대적으로 센서 헤드(sensor head)의 길이가 길어지고 그 구조가 복잡해지는 단점이 존재하였다. 본 논문에서는 테이퍼된 NCF(tapered NCF: 이하 TNCF)의 다중 모드 간섭(multi-mode interference: 이하 MMI)을 이용한 비교적 단순한 구조의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 센서를 제안한다. 이전 연구들을 통해 SARS - CoV - 2는 사람에게 감염되는 과정에서 앤지오텐신 분해 요소 2(angiotensin - converting enzyme 2: 이하 ACE 2)와 결합한다는 사실이 밝혀졌으며^[16], 이를 통해 ACE 2 항체를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 검출 가능성이 제시되었다. 따라서, 본 연구에서는 ACE 2 항체가 표면에 고정된 TNCF를 센서 헤드로 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 검출하고자 한다. 2장에서는 TNCF 표면에 ACE 2 항체를 고정하기 위해 사용되는 화학 약품들에 대해 기술할 것이며, 3장에서는 TNCF 기반 센서 헤드 제작 및 측정 원리에 대해 기술하고자 한다. 그리고 4장에서는 항체 고정 과정 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 결과에 대해 기술하고, 마지막으로 5장에서 결론을 통해 연구 결과를 마무리하고자 한다.

2. ACE 2 항체 고정용 화학 약품

TNCF에 ACE 2 항체를 고정하기 위해 사용된 화학 약품들의 상세 명칭 및 제조사는 아래와 같다. 황산(H$_{2}$SO$_{4}$), 과산화수소(H$_{2}$O$_{2}$) 및 에탄올(C$_{2}$H$_{2}$O)은 삼천 화학(한국) 제품을 사용하였으며, 3-아미노프로필트리에톡시실란((3-aminopropyl) triethoxysilane: 이하 APTES), 글루타르알데히드(glutaraldehyde: 이하 GA), 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline: 이하 PBS) 10 mM(ph 7.4)은 Sigma-Aldrich사(미국) 제품을 사용하였다. 또한, 증류수(distilled water: 이하 DI), 1 - 에틸 –3 - (3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide: 이하 EDC), N-하이드로시술포석신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide: 이하 sulfo- NHS)는 Thermo Fisher Scientific사(미국) 제품을 사용하였고, 인체 ACE 2 단백질과 SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 Sino Biological사(중국) 제품을 사용하였다. 마지막으로 소혈청 알부민(Bovine Serum Albumin: 이하 BSA)은 GenDEPOT사(미국) 제품을 사용하였다.

3. 센서 제작 및 측정 원리

NCF를 테이퍼링 하기 위해 우선 직경이 125μm인 Thorlabs 사의 NCF(FG125LA)를 각각 10mm씩 재단하였다. 재단된 두 NCF는 Fig. 1(a)와 같이 아크 융착 접속기(arc fusion splicer: 이하 AFS)(Fujikura 사의 FSM-60S) 내부에 있는 V자 홈(groove)에 위치시켰다. 두 NCF가 융착 접속되는 세부 조건을 조절하여 접속된 부분에 테이퍼된 영역이 만들어지도록 하였다. 상기 세부 조건으로 융착 접속 시 끌어당기는 속도설정값, 아크 지속 시간, 그리고 접속 시 끌어당기는 길이는 각각 20, 8000ms, 100μm이었다. 이러한 융착 접속 조건으로 초기 직경이 125μm인 두 NCF를 융착 접속함으로써 접속부의 광섬유 직경이 ∼105 μm로 가늘어진 TNCF를 구현하였다. Fig. 1(b)는 제작된 TNCF의 중심부를 현미경으로 촬영한 모습을 보여준다.

Fig. 1. Fabrication of a TNCF (a) schematic diagram of two NCF segments located on V grooves inside AFS before arc fusion splicing and (b) microscopic image of fabricated TNCF

TNCF는 단일 모드 광섬유(single-mode fiber: 이하 SMF)와 양단이 연결될 경우, TNCF와 SMF 간 모드 필드 불일치(mode-field mismatch)로 인해 입력단 SMF와 NCF 사이에서 고차 모드(high-order mode)들이 여기되고, 이러한 고차 모드들은 NCF와 출력단 SMF 사이에서 MMI를 발생시킨다. 여기되는 고차 모드의 개수는 정규화 주파수(normalized frequency) V에 의해 결정이 되는데, V가 20보다 크면 모드 개수 N은 V2/2에 비례한다. 여기서, 정규화 주파수 V는 식(1)과 같이 주어진다.

위 식에서 a는 광섬유 코어(core)의 반경, λ는 진공 중의 파장, ncore 및 ncladding은 각각 코어 및 클래딩(cladding)의 굴절률을 의미한다. 하지만 식(1)은 MMF를 기준으로 표현된 것이므로, 클래딩이 없는 NCF의 경우에는 NCF의 굴절률과 NCF를 둘러싸고 있는 주변 굴절률을 이용하여 식(1)을 식(2)와 같이 수정할 수 있다.

위 식에서 aNCF는 NCF의 반경, nNCF 및 nMedium은 각각 NCF 및 NCF 주변 매질(surrounding medium)의 굴절률을 나타낸다. 또한, 양단에 SMF를 연결한 NCF 구조(SMF-NCF-SMF 구조)를 통과한 빛의 파장에 따른 투과율을 구하는 경우에도 MMF에 적용되는 약도파 근사(weakly guiding approximation) 대신 차단 무관 근사(far-from-cutoff approximation) 방식을 적용하였다. SMF 및 NCF가 이상적으로 정렬되어 있다고 가정하면, 차단 무관 근사를 적용하여 얻어지는 SMF-NCF-SMF 구조의 투과율은 식(3)과 같이 주어진다^[17].

여기서 η0m, z, β0m은 각각 고차 모드와 여기장(excitation field)의 에너지 비율, NCF의 길이, LP0m 모드의 전파 상수를 의미한다. 특히, NCF 내부에서 진행하는 빛은 고차 모드일수록 NCF 외부 영역으로 빠져나가는 비율이 증가한다. 이러한 고차 모드가 테이퍼된 NCF 영역을 진행할 경우, 외부 영역으로 빠져나가는 비율이 증가하여 테이퍼된 NCF 영역에서의 소멸장(evanescent field) 크기도 증가하고 고차 모드는 외부 굴절률에 더욱 민감하게 된다^[18]. SMF-TNCF-SMF 구조에서 TNCF의 테이퍼 영역까지 통과한 여러 모드의 빛은 모드별 광 경로차(optical path difference)에 의해 출력단 SMF에서 MMI를 발생시킨다.

Fig. 2는 본 논문에서 제작된 SMF-TNCF- SMF 구조에서 발생하는 MMI 스펙트럼을 보여주고 있다. MMI 스펙트럼의 여러 공진 골(resonance dip) 중 Dip A 및 Dip B는 추후 센서 표시자(sensor indicator)로 사용하였다.

Fig. 2. Transmission spectrum of MMI caused by high-order modes excited within TNCF

제작된 SMF-TNCF-SMF 구조의 MMI 스펙트럼에 대해 외부 굴절률에 대한 반응성을 조사하기 위해, 설탕 수용액(sucrose solution)을 0% ∼ 50%까지 10% 단위로 준비하였다. 굴절률 반응성 조사를 위한 실험 셋업은 Fig. 3에 제시된 모식도와 같이 구성하였다. 우선 증폭자발방출(amplified spontaneous emission: 이하 ASE) 광원과 광 스펙트럼 분석기(optical spectrum analyzer: 이하 OSA) 사이에 제작된 SMF-TNCF-SMF 구조를 연결하고, 수용액을 주입할 플레이트(plate) 위에 이 SMF-TNCF-SMF 구조를 스카치 테이프(scotch tape)와 자석을 이용하여 고정시켰다.

Fig. 3. Schematic diagram of experimental setup to investigate dependence of fabricated SMF-TNCF-SMF structure on external refractive index

플레이트에 고정된 광섬유 구조에 0% ∼ 50% 농도의 설탕 수용액을 저농도부터 고농도 순으로 주입하면서 MMI 스펙트럼의 변화를 측정하였다. 설탕 수용액의 농도를 변화시킬 때마다 DI로 충분히 세척을 진행한 후 농도를 증가시킨 수용액을 주입하였다. 외부 굴절률에 대한 제작된 SMF-TNCF-SMF 구조의 MMI 스펙트럼 변화는 Fig. 4(a)와 같이 측정되었다. Fig. 4(b)는 Dip A와 Dip B 근처에서의 스펙트럼 변화를 확대해서 보여주고 있다. Fig. 5는 외부 굴절률에 따른 Dip A 및 Dip B의 파장 이동량에 대한 선형 회귀 분석 결과를 보여주고 있다. 설탕 수용액 0% ∼ 50%에 대한 Dip A 및 Dip B의 굴절률 민감도는 각각 ∼65.60 및 ∼73.01nm/refractive index unit(RIU)로 측정되었으며, 파장 이동의 선형성을 나타내는 보정 R2 값은 각각 0.99803 및 0.99764로 계산되었다. 결과적으로 제작된 SMF-TNCF-SMF 구조에서 발생되는 MMI 스펙트럼에서 센서 표지자로 지정한 두 공진 골은 외부 굴절률에 대해 매우 선형적으로 반응한다는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 4. Change of output spctra (a) dependence of MMI spectrum of fabricated SMF-TNCF-SMF structure on external refractive index (sucrose solution) and (b) zoomed spectra near Dip A and Dip B

Fig. 5. Wavelength shifts of Dip A and Dip B, induced by refractive index variation from 1.3330 to 1.4201 (implemented by sucrose solution of 0% to 50% in concentration)

4.표면 항체 고정 과정 및 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 결과

전술하였던 바와 같이 이전의 많은 연구에 의해 SARS-CoV-2는 ACE 2 인체 항체와 결합한다는 사실이 밝혀졌다^[16]. 따라서 제작된 SMF-TNCF-SMF 구조에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질이 선택적으로 부착될 수 있도록 ACE 2 수용체를 제작된 광섬유 구조 표면에 고정하고자 하였다. Fig. 6은 TNCF 표면에 ACE 2를 고정하기 위해 필요한 표면 처리(surface treatment) 과정을 총 다섯 단계로 구분하여 대략적인 모식도로 표현한 것이다. 각 단계가 의미하는 바는 다음과 같다.

1) 광섬유 표면의 유기물 제거: TNCF 영역의 잔류 유기물(organic residue)을 제거하기 위해 황산과 과산화수소를 3:1의 비율로 혼합하여 제작한 피라냐(piranha) 용액에 TNCF를 30분 동안 상온에서 배양하였다.

2) 아민기(-NH$_{2}$) 생성: TNCF 표면을 실란화(silanization)하기 위해서는 우선 표면에 아민기가 생성되어야 한다. 이러한 아민기를 생성하기 위해 10%(volume/volume : 이하 v/v) 비율로 에탄올에 APTES를 녹인 용액에 TNCF를 1시간가량 배양하고 난 뒤 에탄올과 DI로 충분히 세척하였다. 세척된 TNCF는 핫플레이트(hot-plate)를 이용하여 105oC에서 30분간 가열하였다. 가열된 TNCF 표면에 생성된 아민기와의 교차연결(cross-linking)을 활성화하기 위하여, 이 TNCF를 5%(v/v) 기준의 GA 용액에 대략 1시간 정도 배양한 후 DI를 이용하여 충분히 세척하였다.

3) 활성 에스테르(ester) 형성: 센서 표면의 결합 효율성을 높이기 위해 DI 1ml에 EDC 62.096mg 비율로 혼합한 용액 10μl와 PBS 1ml에 sulfo-NHS 57.545mg 비율로 혼합한 용액 20μl, 그리고 10mM PBS 170μl를 섞어서 EDC/sulfo-NHS 용액을 제조하였다. 제조된 용액에 표면 실란화된 TNCF를 상온에서 1시간 정도 배양하여 결합 효율을 높이는 활성 에스테르 형성을 유도하였다.

4) ACE 2 항체 고정: EDC/sulfo-NHS 처리까지 끝난 후, TNCF를 100μg/ml의 ACE 2 용액에 약 2시간 30분 정도 배양하여 TNCF 표면에 ACE 2를 고정시켰다. 이후, TNCF 표면에 고정되지 않은 ACE 2를 제거하기 위해 10mM PBS로 세척을 진행하였다.

5) ACE 2 비고정 영역 보호: TNCF 표면에 고정되지 않은 ACE 2를 제거한 뒤, ACE 2가 고정되지 않은 TNCF 표면의 국소 영역에 외부 물질이 부착되는 것을 막기 위해 10mM PBS를 완충제로 사용한 1% 비율의 BSA 용액에 TNCF를 15분간 배양하였다.

Fig. 6. Surface treatment processes for ACE 2 immobilization on TNCF surface

Fig. 7(a)는 일련의 표면 항체 고정 과정에서 제작된 SMF-TNCF-SMF 구조의 MMI 스펙트럼이 변화되는 모습을 보여주고 있다. MMI 스펙트럼은 BSA로 ACE 2 비고정 영역을 보호하기 이전까지는 장파장 영역으로의 미세한 파장 이동을 보였으며, BSA 용액 처리 순간 다시 단파장 영역으로 이동하는 것을 확인하였다. 특히, Fig. 7(b)와 같이 ACE 2 항체가 고정된 SMF-TNCF-SMF 구조는 ACE 2 항체가 고정되지 않은 구조에 비해 MMI 스펙트럼이 ∼2.12nm 만큼 장파장으로 이동하는 것을 확인하였다. 이러한 스펙트럼 상의 파장 이동을 통해 SMF-TNCF-SMF 구조에서 TNCF 표면 상 ACE 2 항체의 고정 여부를 확인할 수 있었다.

Fig. 7. Change of output spectra (a) Variations of MMI spectrum of SMF-TNCF-SMF structure during ACE 2 antibody immobilization process and (b) MMI spectra of untreated(i.e., bare) and treated(i.e., ACE 2-immobilized) SMF-TNCF-SMF structure

다음으로 항체가 고정된 TNCF 센서부(즉, SMF -TNCF-SMF 구조)를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 실험을 진행하였다. 실험 셋업은 외부 굴절률에 대한 반응성을 조사하기 위해 사용하였던 Fig. 3의 셋업과 동일하게 구성하였다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 샘플 용액의 농도에 따른 센서부의 반응을 조사하기 위해 100μg/ml (DI 1ml에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 100μg 희석)의 샘플 용액을 10mM PBS를 완충재로 사용하여 1ng/ml부터 104ng/ml까지 10배 간격의 농도를 갖는 샘플 용액을 준비하였다. 본 실험에 앞서 ACE 2가 고정되지 않은 TNCF 센서부의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 반응을 먼저 측정한 뒤, ACE 2를 고정한 TNCF 센서부에 대하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 농도별 투과 스펙트럼의 변화를 측정하여 ACE 2 항체가 측정 결과에 미치는 영향을 평가해보았다. Fig. 8에서는 표면처리 이전의 TNCF 센서에 대한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 반응 시 나타나는 출력 스펙트럼의 변화 양상을 나타내었다. Fig. 8(a)에서 알 수 있듯이 ACE 2가 고정되지 않은 TNCF 센서부에 대해 SARS- CoV-2 스파이크 단백질 농도별 투과 스펙트럼의 변화를 보여주고 있으며, Fig. 8(b)는 Dip A와 Dip B 근처 파장 대역에서 확대된 투과 스펙트럼을 보여주고 있다. Fig. 8(b)의 결과에서 Dip A는 최소 ∼1474.82nm에서 최대 ∼1474.86nm로 ∼0.02nm의 파장 변화(Δλ)를 보여주며, Dip B는 최소 ∼1541.86nm에서 최대 ∼1541.92nm로 Δλ가 ∼0.06nm인 것을 알 수 있다.

Fig. 8. Change of output spectra (a) Measured MMI spectra of untreated SMF-TNCF-SMF structure when the sample concentration of SARS-CoV-2 spike protein increases from 1 to 104ng/ml and (b) zoomed spectra near Dip A and Dip B

이와 달리, Fig. 9에서는 TNCF 센서부의 항체 고정처리를 한 후, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 반응 시 나타나는 출력 스펙트럼의 변화 양상을 나타내었다. Fig. 9(a)에서 알 수 있듯이 ACE 2 항체를 고정한 TNCF 센서부를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 샘플 용액의 농도에 따른 TNCF 센서부 투과 스펙트럼의 변화를 보여주고 있다. Fig. 8(b)와 마찬가지로 Fig. 9(b)도 Dip A와 Dip B의 파장 변화를 자세히 살펴보기 위해 두 센서 표지자 근처 파장 대역에서 확대된 투과 스펙트럼을 보여주고 있다. Fig. 9(b)의 결과로부터 샘플 농도가 1ng/ml부터 104ng/ml까지 변화될 때 Dip A의 파장 변화량 Δλ는 ∼0.78nm, Dip B의 Δλ는 ∼1.18nm임을 알 수 있었다. Fig. 10은 Fig. 8과 9에 제시된 두 센서 표지자들(Dip A 및 Dip B)의 샘플 농도에 따른 파장 변화량을 도시한 결과로서 ACE 2 항체가 처리(고정)된 TNCF 센서부와 ACE 2 항체가 처리되지 않은 TNCF 센서부에서 얻어진 결과를 각각 적색 원형 및 청색 사각형 기호들로 표시하였다. 여기서 Dip A 및 Dip B의 파장 변화량(Δλ) 결과는 각각 상부 및 하부 그림(Fig. 10)에 나타내었다. Fig. 10으로부터 항체 처리되지 않은 센서부의 결과는 항체 처리된 센서부의 결과와 비교할 때 샘플 농도의 증가에 따른 경향성을 띄지 않는다는 것을 알 수 있다. 이는 센서부에 고정된 항체가 샘플 검출에 큰 영향을 미치고 있음을 반증한다. 항체가 고정된 센서부의 경우 Dip A와 Dip B의 샘플 농도에 따른 Δλ 민감도는 각각 ∼54.42pm/(μg/ml) 및 ∼79.55pm/(μg/ml)로 측정되었으며, 항체가 고정되지 않은 센서부에 비해 매우 큰 민감도를 가진다는 것을 알 수 있었다. 결과적으로 일련의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 실험들을 통해 ACE 2 항체가 고정된 TNCF 센서부는 1∼104ng/ml 범위의 농도를 갖는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 검출하는 것이 가능하다는 것을 실험적으로 검증하였다.

Fig. 9. Change of output spectra (a) Measured MMI spectra of ACE 2 - immobilized SMF-TNCF -SMF structure when the sample concentration of SARS-CoV-2 spike protein increases from 1 to 104ng/ml and (b) zoomed spectra near Dip A and Dip B

Fig. 10. Wavelength shifts of two sensor indicators (i.e., Dip A and Dip B) of untreated(blue squares) and treated(red circles) sensor heads perturbed by sample solutions of SARS-CoV-2 spike protein

5. 결 론

본 연구에서는 상용 AFS를 이용하여 초기 125μm의 직경을 갖는 NCF를 직경 ∼105μm로 테이퍼링하여 SMF-TNCF-SMF 구조를 제작하고, TNCF 영역에 ACE 2 항체를 고정하여 기능화한 뒤 TNCF 센서부의 MMI 스펙트럼을 측정하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 성능을 조사하였다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출 실험에 앞서 제작된 TNCF 센서부의 검출 적합성을 판단하기 위해 여러 농도의 설탕 수용액을 이용하여 외부 굴절률 민감도를 우선적으로 조사하였다. 제작된 TNCF 센서부의 외부 굴절률 민감도는 센서 표지자로 사용된 Dip A 및 Dip B에서 각각 ∼65.60 및 ∼73.01nm/RIU로 측정되었으며, SARS-CoV-2 스파이크 단백질 검출에 충분한 외부 굴절률 민감도를 지니는 것을 확인하였다. 다음으로 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 ACE 2 수용체의 결합 친화력을 검출에 활용하기 위해 5단계의 표면 처리 과정을 거쳐 TNCF 센서부 표면에 ACE 2 항체를 고정하였다. 또한, ACE 2 항체 고정이 정상적으로 이루어지는지를 판단하기 위해 센서부 표면 처리 전체 과정에서 TNCF 센서부의 투과 스펙트럼을 모니터링하였다. 본 실험으로 ACE 2 항체 고정된 TNCF 센서부와 항체가 고정되지 않은 센서부를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 샘플의 농도별 센서 표지자 파장 변화량 Δλ를 각각 측정하여 검출 성능을 비교하였다. 결과적으로 ACE 2 항체가 고정된 TNCF 센서부를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 농도별로 검출할 수 있다는 것을 실험적으로 증명하였다. TNCF 센서부를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 검출한 본 연구 결과는 간단하고 신속한 바이러스 단백질 검출 방식으로 활용될 수 있으며, 적절한 항원-항체 반응을 채택할 경우 향후 발생할 수 있는 다양한 바이러스 검출을 위해서도 응용될 수 있을 것으로 사료된다.