2.1 비타민D의 작용과 합성

비타민 D는 체내에서 합성되어 일반적인 비타민이라기보다는 내분비 기능뿐만 아니라 자가분비와 측분비 기능을 가지는 호르몬성 비타민으로 볼 수 있다. 비타민 D의 종류는 D1-D7이 있으며 생리활성을 가지는 비타민은 D2(Ergocalciferol)와 D3(Cholecalciferol)만 존재한다. 이중 비타민 D2는 주로 식물에 의해 합성되며 비타민 D3는 UV(Ultra Violet)-B 파장(280-320nm)의 빛에 노출되었을 때 피부에서 합성된다^(2-5).

비타민 D의 급원은 대부분이 햇빛에 의해 만들어지며, 식품으로 섭취되는 비타민 D의 양은 약 10-20% 로 많지 않다. 한국영양학회가 제안한 19세-64세 성인의 하루 비타민 D 권장량인 400IU (10㎍)을 음식으로 섭취하기 위해서는 달걀 10개 또는 우유 600㏄, 연어 1마리 등이 필요하다. 따라서, 비타민 D는 음식을 통해 섭취하는 것보다 UV-B 노출에 의한 피부 합성이 효율적이라 할 수 있다.

UV-B 파장의 빛을 피부에 노출 시키면 Fig. 1과 같이 피부의 7-dehydrocholesterol(Provitamin D3)이 Previtamin D3로 전환된다. Previtamin D3는 열에 의해 비타민 D3로 이성화(Isomerization)된다. 이성화된 비타민 D3는 생리적 비활성 상태이며 피부세포 밖으로 분비되어 혈관을 타고 간으로 이동하여 간세포에 의해 25(OH)D3로 수산화된다. 수산화된 25(OH)D3는 혈관을 통해 신장으로 이동하여 신장 세포에 의해 1,25(OH)2D3로 한 번 더 수산화되어 마침내 생리적 활성 상태가 된다. 생리적 활성 상태가 된 1,25(OH)2D3를 활성형 비타민 D라고 하며 혈관을 통해 온 몸의 각 조직 세포에 가서 비타민 D의 기능을 수행한다⁽⁶⁾.

또한 Fig. 2와 같이 피부의 각질세포(조직 및 면역세포 포함)도 자체적으로 수산화 효소(CYP27A1, CYP27B1)를 가지고 있어 CYP27A1 효소에 의해 비활성화된 비타민 D3를 25(OH)D3로 수산화하고 이를 다시 CYP27B1 효소로 수산화하여 1,25(OH)2D3 자체 생성한다^(7-8).

신장에서 수산화된 1,25(OH)2D3와 각질세포에서 수산화된 1,25(OH)2D3는 서로 작용 특성이 다르다. 신장에서 수산화된 1,25(OH)2D3는 소장 세포에서 비타민 D 의존-칼슘 수송 단백질의 생성을 조절하며 칼슘과 인의 흡수를 증가시키는 골 대사에 작용한다. 반면, 각질세포와 같이 면역 세포에서 전환되는 1,25(OH)2D3는 세포 증식이나 고사, 분화, 혈관 생성, 면역조절과 같은 숙주 방어기전에 관여 한다⁽⁹⁾. 이에, 본 연구에서는 UV-B 파장 조명에 따른 비타민 D 생성 효과를 확인 하기 위한 실험을 수행하였다. 단, 신장에서 생성되는 비타민 D 효과를 확인하기 위해서는 동물 시험이 필요하기에 초기 실험으로 UV-B 파장 조명조사에 따른 각질세포(Human Keratinocyte)에서의 1,25(OH)2D3 생성 시험을 진행하였다.

2.2 선행연구 고찰

황덕상 외 2인은 UV-B 조사에 의한 혈중 칼슘, 비타민 D, 콜레스테롤의 농도 변화로 골다공증의 예방과 치료 가능성을 알아보기 위해, 폐경기 여성 50명을 대상으로 연구를 수행하였다. 연구 결과, 2주간 지속적인 UV-B 조사를 통해 혈중 칼슘, 비타민 D의 농도가 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, 콜레스테롤 농도는 통계적으로 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다⁽¹⁰⁾.

곽민경 외 1인은 대한민국 국민의 비타민 D 결핍 문제를 해결하기 위해 한반도의 EUV-B 특성을 분석하여 적정 비타민 D 합성을 위한 노출시간을 제안하였다. 피부 면적 6-10%를 태양광에 노출할 경우 비타민 D 200IU를 생성하기 위해서 봄에는 15분, 여름에는 12분, 가을에는 18분, 겨울에는 37분의 노출 시간이 필요함을 보고하였다⁽¹¹⁾.

문유섭은 자외선 과다 노출을 막고 적정한 피부 노출 시간 산정에 기준이 되는 한반도 표준 자외선 지수를 개발하고 한국인 최소 피부홍반점의 감응 시간을 추정하였다. 한국인 중 40mJ/㎠의 최소홍반 에너지를 요구하는 피부타입에 대해서는 태양광에 약 30분 노출시 홍반이 발생되었으며, 75mJ/㎠의 최소홍반 에너지를 요구하는 일반적인 피부타입의 경우 60분정도 노출시에 홍반이 발생하는 것을 확인하였다⁽¹²⁾.

Lee 외 1인은 UV-B 조사에 따른 인간각질세포 손상 연구를 수행하였다. UV-B 조사 세기를 0mJ/㎠, 20 mJ/㎠, 30mJ/㎠, 40mJ/㎠, 50mJ/㎠으로 설정하여 세포 사멸 시험을 진행한 결과, 30mJ/㎠ 이상 UV-B 조사 세기에서 세포 사멸이 발생함을 확인하였다⁽¹³⁾.

오정환 외 5인은 UV-B 조사에 따른 피부 손상을 최소화하기 위해 쇠비름 추출물을 사용하여 인간각질형성세포 광노화 억제 효과를 확인하였다⁽¹⁴⁾.

조수경 외 2인은 비타민 D 결핍에 따른 우울증 발생 위험도 증가 경향을 분석하였다. 분석 결과, 일부 국외 임상시험 연구를 통해 비타민 D 결핍이 우울증 발생과 연관성이 있음을 확인하였으나 연관성이 없음을 확인한 선행연구도 다수 수행되어 한국인을 대상으로한 후속 연구가 필요함을 제안하였다⁽¹⁵⁾.

오승택 외 3인은 실내 전반 조명을 이용하여 하루 자연광 노출을 통해 받게 되는 EUVB의 방사량을 제공하기 위해 UVB-LED 전반 조명을 설계하였다. 20mW UVB-LED 광원 12개를 적용하여 전반 조명기구 제작시 실내 전반 조명을 통해 비타민 권장량 충족이 가능함을 확인하였다⁽¹⁶⁾.

3.1 UV-B LED 조명기구 제작

UV-B LED 조명기구 제작을 위해 렌즈 타입 UV-B LED PKG와 평면 타입 UV-B LED PKG를 선정하여 광학 특성을 측정하였다. Fig. 3과 같이 두 가지 타입 모두 피크 파장 305nm, Radiant flux 15.7mW (IF = 350mA)로 동일하게 측정되었지만, Fig. 4와 같이 렌즈가 없는 평면 타입의 배광곡선이 렌즈 타입의 배광곡선보다 고르고 넓게 분포하여 평면 타입의 UV-B LED PKG를 사용하여 시험용 조명기구를 제작하였다.

조명기구 형태는 각질세포 배양 dish에 고르게 조사하기 위해 Fig. 5와 같이 Par 타입으로 제작하였으며, 256단계 조절이 가능한 조광기와 자동 조명제어 타이머를 연결하여 UV-B 조명 세기와 조사 시간을 조절하였다.

3.2 비타민 D 생성 시험 설계

실제 사람의 피부는 3차원 구조로 세포가 형성되어 주광에 노출되어도 피부 손상이 크게 발생하지 않지만 본 시험에서 사용되는 각질세포는 얇은 막 형태로 구성되어 있어 매우 낮은 광량의 UV-B 노출에도 세포 사멸이 발생한다. 따라서, 선행연구 분석을 통해 각질세포 사멸이 발생하지 않는 UV-B 방사 총량(20mJ/㎠)을 산출하였다⁽¹³⁾.

UV-B LED 조명기구의 조광 단계별 UV-B 방사 특성을 고려하여 UV-B 방사 강도를 4단계(0.1312 W/㎡, 0.0875W/㎡, 0.0440W/㎡, 0.0212W/㎡)로 설정하였다. 설정된 UV-B 방사 강도별 UV-B 방사 총량 20mJ/㎠을 충족시키기 위한 방사 시간을 산출하였다.

예를 들어, UV-B 방사 강도 0.1312W/㎡의 경우 UV-B 방사 총량 20mJ/㎠을 충족시키기 위해 20mJ/㎠을 0.1312W/㎡로 나누면 1,524초(약 25분)가 산출된다. 이와 같이 4가지 UV-B 방사 강도별 4가지 노출시간을 산출하여 대조군 포함 총 17가지 시험 조건을 설정하였다. Table 1과 같이 G4, G7, G10, G13 시험 조건의 경우 UV-B 방사 총량 20mJ/㎠을 충족시키며 나머지 시험 조건은 UV-B 방사 총량 20mJ/㎠을 초과하거나 미달하도록 설정하였다.

시험 대상인 각질세포는 조명 노출 전 배양 및 안정화 단계를 거친 후 시험 조건에 따라 UV-B 조명을 조사하였다. UV-B 조명 조사가 완료되면 24시간 배양을 진행한 뒤 세포 사멸 및 1,25(OH)2D3 생성량을 분석하였다. 시험 결과의 통계적 유의성 확보를 위해 시험 조건별 3회 반복 시험을 진행하였다(Fig. 6).

4.1 시험계 및 시험군

시험계 Cell line: HaCaT cell (Human Keratinocyte)을 사용하여 시험군 총 17군 (n=3), 총 51개 세포를 배양 하고 UV-B 조명 조사 시험을 수행하였다.

4.2 세포배양 및 UV-B 조사

4.3 Sample preparation

4.4 단백질 정량 (Protein assay)

Pierce™ , 96well plate에 BCA standard와 세포 용해물를 5μl씩 넣은 후, BCA reagent A와 BCA reagent B를 50:1로 섞은 후 각 well에 200μl 첨가하여 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 plate는 microplate reader를 이용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다.

4.5 ELISA (1,25(OH)2D3 measurement)

Pre-coated well에 standard와 sample을 각각 100 μl씩 넣은 후, sample이 들어간 well에는 Balance solution을 10μl씩 첨가하였다. Conjugate를 각각의 well에 50μl씩 넣은 후 잘 섞어주고 sealing film으로 plate를 sealing한 후 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 well을 1× wahs solution으로 5회 세척한 후 wash solution을 제거하고, 50μl substrate A와 50 μl substrate B soluation을 각각의 well에 넣어주고 차광한 상태에서 15-20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 50μl의 stop solution을 넣은 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Standard curve를 토대로 pg/ml의 1,25(OH)2D3 농도를 구한 후, 단백질 정량결과로 보정하여 ‘pg/mg protein’으로 1,25(OH)2D3 농도를 산출하였다.

4.6 시험 결과

통계처리 프로그램 SPSS를 사용하여,각 시험군별 3회 반복 시험한 1,25(OH)2D3 생성량의 평균값 및 P values 를 Fig. 7과 Table 2에 나타냈다. G1, G2, G5, G7 시험군에서 1,25(OH)2D3가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며, cell morphology의 결과(Fig. 8)와 비교해 볼 때 G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, G9 시험군에서 세포 사멸이 뚜렷하게 나타났다. 따라서, G1, G2, G5, G7 시험군은 1,25(OH)2D3 생성 효과가 유의적으로 나타났으나 세포 사멸이 발생하였으므로 다소 UV-B 노출량이 높은 것으로 사료된다. 세포사멸이 일어나지 않는 시험군의 경우에는 1,25(OH)2D3가 증가하는 양상이 보였으나, 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.